호 중구 Extracellular 함정 밀도가 낮은 호 중구에 의해 생성 된 종양 세포 성장 및 첨부 파일 중재 하십시오 복 막 게 액체에서 얻은
Summary
여기, 우리는 인간의 저밀도 호 중구 (LDN), 수술 후 복 막 게 액체에서 회복 대규모 호 중구 extracellular 함정 (그물)를 생산 하 고 이후에 성장 하는 무료 종양 세포를 효율적으로 트랩 방법을 제시.
Abstract
호 중구 릴리스 호 중구 extracellular 함정 (그물), 캡처 및 미생물을 파괴할 수 있는 활성화. 최근 연구 제안 그물 자가 면역 질환, 혈전 증, 및 종양 전이 등 다양 한 질병 과정에서 포함 된다. 여기, 우리는 그물을 부착 후 성장 무료 종양 세포의 트래핑 동안 NET 활동을 감지 하 상세한 생체 외에서 기술을 보여줍니다. 첫째, 우리는 laparotomies 수술 환자에서 수술 후 복 막 게 액체에서 낮은 밀도 neutrophils (LDN)를 수집. LDN의 단기 경작 녹색 형광 핵과 염색체 counterstain 가시화 했다 거 대 한 그물 형성 결과. 인간의 위 암 세포 라인 MKN45, OCUM-1 및 NUGC-4 그물의 공동 화, 후 많은 종양 세포는 그물에 의해 갇혀 있었다. 그 후, 첨부 파일 DNase I. 계시 노출 인 비디오 공개 종양 세포는 그물에 의해 갇혀 죽지 않 았와 그물의 저하에 의해 완전 하 게 폐지 했다 하지만 대신 적극적으로 지속적인 문화에서 성장 했다. 이러한 메서드는 그물과 다양 한 유형의 세포 및 물자 사이 접착 상호 작용의 탐지에 적용할 수 있습니다.
Introduction
혈액 순환에 다형 핵 호 중구 밀도 그라데이션 준비 방법을 통해 단 세포에서 일반적으로 분리 된다. 그러나, CD11b(+), CD15(+), CD16(+), 그리고 CD14(-) 고기와 저밀도 neutrophils (LDN)로 알려진 일부 호 중구는 공동 단 세포로 순화. LDN의 상대 수 면역 질환1,2, 암4,5, 패 혈 증3, 등 다양 한 병 적인 조건에서 크게 증가 합니다. 이전 연구는 LDN의 호 중구6phenotypically 및 기능적으로 뚜렷한 클래스 나타났습니다. 그것은 혈액 순환에 LDN 더 정상적인 밀도 호 중구2,7보다 호 중구 extracellular 함정 (그물)를 생산할 가능성이 있습니다 주목 해야한다. 그물 핵 산, 히스톤, 프로 테아 제, 그리고 세밀 하 고 cytosolic 단백질의 구성 하는 웹-같은 구조 이며, 그들은 효율적으로 모 함 하 고 병원 균8파괴.
최근, 그물 캡처 뿐만 아니라 미생물, 하지만 또한 혈소판 혈전 형성9 및 종양 전이10,11에 지원할 수 있는 종양 세포를 순환 표시 되었습니다. 그러나, 뒤에 그물과 혈소판 또는 종양 세포 사이 접착 상호 작용 분자 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 더 최근에, 생체 외에서 접착 분석 결과 골수성 백혈병 세포 (K56212) 폐 암 세포 (A54913) 연결 및 그물을 β1와 β3 integrins를 통해 밝혔다. 저자 호 중구에서 고립 그리고 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 접착 기판14에 의해 활성화 인터넷 주식 사용. 이 분석 결과 호 중구의 부재에서 NET 구성 요소와 실제 상호 작용의 탐지를 허용, 그것은 arguable 여부 그물 생산 에서 동일한 분자 구조를 유지는 “셀-무료 인터넷 주식” 고속 원심 분리에 의해 분리 vivo. 최근에, 우리는 복 부 수술 포함 거 대 한 그물을 생성 하 고 복 막 전이15발생 하는 종양 세포에 연결 된 많은 성숙한 LDN 후 그 게 복 막 액체를 발견. 이 연구에서 우리는 성공적으로 어떤 물리적 조작 없이 그대로 그물에 종양 세포의 접착을 시험 했다. 여기, 우리는 그물과 무료 종양 세포 사이 접착 상호 작용을 검출 하는 기법의 세부 정보를 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이전 연구는 종양 세포를 순환 수 있습니다 갇혀 있을 NET 기판10, vivo에서11보고 있다. 전이성 유방암 세포 자극 하는 호 중구 및 대상 기관17에서 종양 세포 성장에는 그물의 대형을 유도 표시 되었습니다. 또한, 우리는 수술 후 게 액체에서 LDN의 단기 문화 수 효율적으로 더 자극15없이 종양 세포를 모 함 하는 거…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 기술 및 사무 작업에 대 한 양 제이 시노하라와 I. Nieda 감사합니다. 또한, 우리 감사 박사 시로 마 츠 모토, 則 Haruta, 켄 타로 쿠라 시, 그리고 카즈야 타카하시 수술 실에 샘플 수집에 대 한 그들의 협력에 대 한. 이 작품은 특정 교육 과학기술부, 과학, 스포츠, 그리고 일본 문화 및 일본 사회에서 과학적인 연구를 위한 과학 진흥 (17 K 10606)에 대 한 지원 했다.
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
