الحصول على العَدلات الفخاخ خارج الخلية التي تم إنشاؤها بواسطة العَدلات منخفض الكثافة من الغسل البريتوني السوائل التوسط نمو الخلايا السرطانية والمرفقات
Summary
نقدم هنا، أسلوب الذي تنتج الفخاخ الضخمة خارج الخلية العَدلات (شبكات) العَدلات منخفض الكثافة البشرية (LDN)، تعافي من سائل الغسل البريتوني بعد العملية الجراحية، وفخ كفاءة الخلايا السرطانية الحرة التي تنمو في وقت لاحق.
Abstract
تفعيل العَدلات الإصدار العَدلات خارج الخلية الفخاخ (شبكات)، الذي يمكن التقاط وتدمر الميكروبات. تشير الدراسات الأخيرة إلى أن شبكات متورطة في عمليات الأمراض المختلفة، مثل الانبثاث المرض وتجلط الدم والأورام الذاتية. وهنا نعرض تقنية مفصلة في المختبر للكشف عن النشاط الصافي أثناء محاصرة الخلايا السرطانية الحرة، التي تنمو بعد الإلحاق لشبكات. أولاً، جمعنا العَدلات منخفض الكثافة (LDN) من سائل الغسل البريتوني بعد العملية الجراحية من المرضى الذين خضعوا لاباروتوميس. استزراع القصيرة الأجل من LDN أسفرت عن تشكيل صافي الضخمة التي كانت تصور مع الأخضر الفلوريسنت النووية وكروموسوم كونتيرستين. بعد الحضانة المشتركة لخطوط الخلايا البشرية سرطان المعدة MKN45 “و” أوكوم-1 “و” نوجك-4 مع الشباك، حوصر العديد من الخلايا السرطانية بالشباك. في وقت لاحق، المرفقات ألغى تماما بتدهور شبكات مع “الوقت الفاصل بين أولاً الدناز” الفيديو كشفت أن الخلايا السرطانية قد وقعت في شرك الشباك لم يمت ولكن بدلاً من ذلك نما بقوة في ثقافة مستمرة. يمكن تطبيق هذه الأساليب للكشف عن التفاعلات لاصقة بين الشباك وأنواع مختلفة من الخلايا والمواد.
Introduction
عادة يتم فصل polymorph العَدلات النووية في تعميم الدم من الخلايا وحيدات النوى من خلال أسلوب إعداد التدرج الكثافة. بيد أن بعض العَدلات المعروف العَدلات منخفض الكثافة (LDN)، مع تعمل CD11b(+)، CD15(+)، CD16(+)، و CD14(-)، المنقي يشترك مع الخلايا وحيدات النوى. العدد النسبي ل LDN زيادة كبيرة في مختلف الحالات المرضية بما في ذلك أمراض المناعة الذاتية1،2، الانتان3و4،السرطان5. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن LDN فئة متميزة فينوتيبيكالي ووظيفيا من العَدلات6. تجدر الإشارة إلى أن LDN في تعميم الدم أكثر احتمالاً لإنتاج العَدلات الفخاخ خارج الخلية (شبكات) من الكثافة الطبيعية العَدلات2،7. شبكات الهياكل الشبيهة بالويب تتألف من الأحماض النووية، هيستونيس، البروتياز، والبروتينات الحبيبية وسيتوسوليك، وأنهم يمكن أن كفاءة الأجهزة وتدمير8من مسببات الأمراض.
في الآونة الأخيرة، أظهرت شبكات لالتقاط ليس فقط الجراثيم، ولكن أيضا الصفائح الدموية وتعميم الخلايا السرطانية التي يمكن أن تساعد في خثرة تشكيل9 والورم الانبثاث10،11. ومع ذلك، أن الآليات الجزيئية وراء لاصقة التفاعلات بين شبكات والصفائح الدموية أو الخلايا السرطانية لا تزال غير واضحة. في الآونة الأخيرة، كشفت مقايسة التصاق في المختبر أن خلايا سرطان الدم النقوي (K56212) وخلايا سرطان الرئة (A54913) إرفاق إلى شبكات عبر integrins β1 و β3. الكتاب يستخدم صافي رصيد المعزولة من العَدلات وتنشيطه بواسطة phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) ك الركيزة التصاق14. على الرغم من أن هذا الفحص يتيح الكشف عن التفاعل الحقيقي مع مكونات صافي في غياب العَدلات، والقول ما إذا كان “الخلية الحرة الأوراق المالية الصافية” معزول بواسطة الطرد المركزي عالية السرعة يحتفظ بنية الجزيئية متطابقة لشبكات إنتاج في فيفو. في الآونة الأخيرة، وجدنا أن السائل البريتوني الغسل بعد عملية جراحية في البطن الواردة LDN ناضجة كثيرة، وإنشاء شبكات واسعة النطاق، وتعلق على الخلايا السرطانية تسبب الانبثاث البريتوني15. في هذه الدراسة، درسنا بنجاح التصاق الخلايا السرطانية لشبكات سليمة دون أي تلاعب المادية. وهنا نعرض تفاصيل تقنية للكشف عن التفاعلات لاصقة بين شبكات وخلايا الورم مجاناً.
Protocol
Representative Results
Discussion
وأفادت الدراسات السابقة أن تعمم الخلايا السرطانية يمكن المحاصرين بركائز الصافية في فيفو10،11. أظهرت خلايا سرطان الثدي المنتشر لحفز العَدلات والحث على تشكيل شبكات، التي تساعد في نمو الخلايا السرطانية في الجهاز الهدف17. وبالإضافة إلى ذلك، وج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر السيدة ج. شينوهارا وندا أولاً للأعمال الفنية والكتابية. أيضا، ونحن نشكر الدكتور شيرو ماتسوموتو وهرتا هيدينوري كوراشينا كينتارو كازويا تاكاهاشي لتعاونها من أجل اكتساب عينة في غرفة العمليات. وأيد هذا العمل معونات “البحث العلمي” من وزارة التعليم والعلوم، الرياضة، والثقافة اليابانية والجمعية اليابانية “النهوض بالعلم” (10606 ك 17).
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
