Réglementation de l’environnement de la chromatine est un processus essentiel nécessaire pour l’expression des gènes appropriés. Nous décrivons ici une méthode pour contrôler l’expression des gènes par le recrutement de modificateurs de la chromatine machines de façon gène-spécifique et réversible.
Régulation de la compaction de la chromatine est un processus important qui régit l’expression des gènes chez les eucaryotes supérieurs. Bien que la compaction de la chromatine et la régulation de l’expression génique sont souvent perturbés dans de nombreuses maladies, une méthode spécifiques d’un locus, endogène et réversible pour étudier et contrôler ces mécanismes d’action a fait défaut. Pour résoudre ce problème, nous avons développé et caractérisé les nouvelles molécules bifonctionnelles régulation génique. Un composant de la molécule bifonctionnel se lie à un point d’ancrage de l’ADN-protéines afin qu’il sera recruté à un locus de l’allèle spécifique. L’autre composante engage les endogène machinerie modifiant la chromatine cellulaire, recrutement de ces protéines à un gène d’intérêt. Ces petites molécules, appelées modificateurs chimiques d’épigénétiques (CEMs), sont capables de contrôler l’expression des gènes et l’environnement de la chromatine de façon dose-dépendante et réversible. Nous détaillons ici, une approche CEM et sa demande visant à diminuer l’expression génique et l’acétylation des histones queue à un journaliste de la protéine fluorescente verte (GFP) situé sur le locus Oct4 dans les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs). Nous caractérisons les devants CEM (CEM23) à l’aide de la microscopie de fluorescence, cytométrie en flux et immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), suivie d’une PCR quantitative (qPCR). Bien que la puissance de ce système est démontrée au locus Oct4 , sur le plan conceptuel, la technologie CEM est modulaire et peut être appliquée dans d’autres types cellulaires et autres locus génomiques.
La chromatine est composée d’ADN enroulé autour des octamère d’histones qui forment la particule nucleosome de noyau. Régulation de la compaction de la chromatine est un mécanisme essentiel pour bon ADN réparation, réplication et expression1,2,3. Une façon dans lequel les cellules contrôlent le niveau de compactage est par le biais de l’ajout ou la suppression de diverses modifications de queue post-traductionnelles histone. Deux adaptations incluent l’acétylation lysine (1), qui est plus communément associée à l’activation de gènes, et la méthylation de la lysine (2), qui peut être associée à l’activation de gènes ou de répression, selon le contexte de l’acide aminé. L’ajout des marques acétylation et méthylation est catalysée par les histones acétyltransférases (chapeaux) et histone methyltransferases (HMTs), respectivement, alors que la suppression de la marque se faite par les histones désacétylases (HDAC) et histone déméthylases (HDMs ), respectivement de4,5. Bien que l’existence de ces protéines est connu depuis des décennies, bon nombre de mécanismes de machines modifiant la chromatine comment fonctionne à réguler correctement l’expression génique reste à définir. Étant donné que le processus de réglementation de la chromatine sont dysrégulation dans plusieurs maladies humaines, nouvelles perspicacités mécanistes pourraient conduire à des applications thérapeutiques futures.
La chromatine essai in vivo avec (CiA) est une technique récemment décrite qui utilise un inducteur chimique de proximité (CIP) pour contrôler le recrutement de machines modifiant la chromatine à un locus spécifique6. Cette technologie a été utilisée pour étudier une liste croissante de la dynamique de la chromatine, y compris la modification des histones des protéines, des rénovateurs de la chromatine et facteurs de transcription6,7,8,9. Axée sur le pic de la chromatine attacher des protéines exprimées de façon exogène a également été étendue au-delà de CiA pour moduler les loci génétiques non modifiés par usage avec une protéine associée à la cluster régulièrement entrecoupées court palindromique répète CRISPR-désactivée (dCas9) 10 , 11. dans le système de la CiA, les mESCs ont été modifiés pour exprimer un gène rapporteur GFP au locus Oct4 , une zone fortement exprimée et strictement réglementé du génome mESC. Auparavant, ce système a été appliqué pour décrire le recrutement réversible et dose-dépendante de protéine de l’hétérochromatine exogène expresse 1 (HP1), une enzyme qui lie H3K9me3 et propage répressifs marques (par exemple, H3K9me3) et l’ADN 6de méthylation. Pour accomplir ce type de stratégie de recrutement, les mESCs sont infectés par un plasmide qui exprime une protéine liant le FK506 (FKBP) liée à un Gal4, qui est un point d’ancrage d’ADN-protéine qui se lie à un tableau de Gal4-liaison en amont du reporter GFP. Les cellules sont également infectés par un domaine de liaison FKBP-rapamycine (FRB) connecté à HP1. Lorsque les mESCs sont exposés à des concentrations nanomolaires faible du pic, la rapamycine, FRB tant FKBP, sont réunis au locus de la cible. Quelques jours après traitement de la rapamycine, l’expression du gène cible est réprimée, comme en témoigne la fluorescence microscopie et écoulement cytometry et l’acétylation des histones est diminuée, ce qui témoigne de la puce et le séquençage de bisulfite. Le développement et la validation de cette approche ont eu des avancées significatives dans le domaine de la recherche de la chromatine et la réglementation, un inconvénient est l’expression exogène nécessaire modification de la chromatine machines.
Pour rendre la technologie basée sur le recrutement de seulement des enzymes endogènes physiologiquement pertinents et faire un système plus modulaire, nous avons conçu et caractérisé les nouvelles molécules bifonctionnelles, appelés CEMs (Figure 1)12. Une des composantes des CEMs comprennent FK506 qui, semblable à la rapamycine, lie étroitement et spécifiquement à FKBP. Ainsi, la SCE est encore recrutés au locus Oct4 dans les mESCs CiA. L’autre composante de la SCE est une fraction qui lie endogène machines modifiant la chromatine. Dans une étude pilote, nous avons testé les CEMs qui contiennent des inhibiteurs d’HDAC. Alors que le concept d’employer un inhibiteur pour recruter des HDACs semble contre-intuitif, l’inhibiteur est néanmoins capable de recruter activité HDAC pour le gène d’intérêt. Ceci est accompli en (1) redirigeant le HDAC au locus, libérant l’enzyme et augmentant la densité des HDACs non inhibés dans la région et l’inhibition d’HDAC (2) maintien au locus, mais recrutement complexes répressives qui se lient à l’HDAC inhibés, ou (3) une combinaison des deux. Dans une étude précédente, nous avons montré que la SCE était capables de réprimer avec succès le reporter GFP de façon dose – et dépendant du temps, ainsi que d’une manière qui a été rapidement réversible (c.-à-d., dans les 24 heures)12. Nous avons caractérisé la capacité de la technologie CEM présentée ici à l’expression de gène de contrôle à l’aide de la microscopie en fluorescence, cytométrie en flux et la capacité de contrôler l’environnement de la chromatine à l’aide de la puce-qPCR6. Nous décrivons ici une méthode pour l’utilisation et de caractériser les CEMs, qui faciliteront l’adaptation de ce système pour répondre à des questions liées à la biologie de la chromatine.
Ici, nous avons décrit le système développé récemment de SCE appliqué pour réguler l’expression des gènes et l’environnement de la chromatine à un gène spécifique de manière dose-dépendante. Nous fournissons une méthode précise pour étudier la dynamique impliquée dans la régulation de l’expression des gènes par le recrutement sélectif des protéines régulatrices spécifiques de chromatine endogène. Il s’agit d’une technologie hautement modulaire qui peut être appliquée pour étudier comm…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier les membres des laboratoires Hathaway et Jin pour leurs discussions utiles. Les auteurs remercient également Dan Crona et Ian MacDonald pour leur lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu en partie par Grant R01GM118653 de la U.S. National Institutes of Health (à N.A.H.) ; et de subventions R01GM122749, R01CA218600 et R01HD088626 de l’US National instituts de la santé (J.J.). Ce travail a été également soutenu par un tier 3 et étudiante au don de l’UNC Eshelman Institut pour l’Innovation (N.A.H et a.m.C, respectivement). Des fonds supplémentaires d’un GM007092 de T-32 (à a.m.C) pris en charge ce travail. Cytométrie en flux données ont été obtenues à l’UNC Flow Cytometry Core Facility financé par une subvention de soutien P30 CA016086 Cancer Center Core à l’UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.
DMEM | Corning | 10-013CV | |
NEAA | Gibco | 11140-050 | |
HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
Sonicator | Covaris | E110 | |
Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
PBS | Corning | 46-013-CM | |
BSA | Fisher | BP9700 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
EDTA | Fisher | S311-100 | |
NaCl | Fisher | S271-1 | |
Glycerol | Fisher | G33-1 | |
Tris | Fisher | BP152 | |
NP40 | Roche | 11754599001 | |
Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
Glycine | Fisher | BP381-500 | |
TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
Lif-1C-alpha – producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |