Method Article

Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

DOI:

10.3791/58222

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September 20th, 2018

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1Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina, 2College of Arts and Sciences, Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, University of North Carolina, 3Chemical Biology and Drug Discovery, Pharmacological Sciences and Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina

In This Article

Summary

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Regolamento dell'ambiente della cromatina è un processo essenziale necessario per l'espressione genica corretto. Qui, descriviamo un metodo per il controllo dell'espressione genica attraverso il reclutamento di modificante la cromatina macchinari in modo gene-specifico e reversibile.

Abstract

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Regolamento di compattazione della cromatina è un importante processo che regola l'espressione genica negli eucarioti superiori. Anche se la compattazione della cromatina e regolazione dell'espressione genica sono interrotti comunemente in molte malattie, un metodo di luogo-specific, endogeno e reversibile per studiare e controllare questi meccanismi d'azione è stata carente. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato e caratterizzato molecole bifunzionali diregolamenti. Un componente della molecola bifunzionale associa a un ancoraggio della DNA-proteina in modo che che saranno assunti per un locus allele-specifico. L'altro componente si impegna endogeno macchinario cellulare modificante la cromatina, reclutamento di queste proteine ad un gene di interesse. Queste piccole molecole, chiamate modificatori epigenetici chimici (CEMs), sono in grado di controllare l'espressione genica e l'ambiente della cromatina in maniera dose-dipendente e reversibile. Qui, dettagliamo un approccio CEM e la sua applicazione per fare diminuire l'espressione genica e l'acetilazione dell'istone coda presso un reporter della proteina fluorescente verde (GFP) situato al luogo del Oct4 in cellule staminali embrionali di topo (mESCs). Ci caratterizzano il piombo CEM (CEM23) utilizzo di microscopia fluorescente, citometria a flusso e immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), seguita da una reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Mentre il potere di questo sistema è dimostrato a livello del locus Oct4 , concettualmente, la tecnologia CEM è modulare e può essere applicata in altri tipi cellulari e in altri loci genomici.

Introduction

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Cromatina è costituito da DNA avvolto intorno alle proteine istoniche istonico che formano la particella nucleosome core. Regolamento di compattazione della cromatina è un meccanismo essenziale per il corretto DNA riparazione, replica e l'espressione1,2,3. Un modo in cui le cellule controllano il livello di compattazione è attraverso l'aggiunta o la rimozione di varie modifiche di coda post-traduzionali degli istoni. Due tali modifiche includono l'acetilazione di lisina (1), che è più comunemente associato con l'attivazione del gene, e (2) lisina metilazione, che può essere a....

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Protocol

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1) coltura di linea delle cellule per la produzione di Lentivirus

  1. Fresco, crescere basso-passaggio (meno di passaggio 30) cellule embrionali umane del rene (HEK) 293T in alto-glucosio Dulbecco s modified Eagle di base media medium (DMEM) completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 10 mM HEPES, 1x gli aminoacidi non essenziali (NEAA), penna / STREP, 2-mercaptoenthanol in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2. Dividere le celle ogni 3-5 p e prima che diventino > 95% confluenti.
  2. Passaggio di cellule HEK 293T con 18 x 106 a 15 cm piatto (uno piatto di 15 cm per ogni virus prodotto).
    1. Per un formato di 15 cm, aspirare i vecchi....

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Results

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Abbiamo recentemente sviluppato CEMs ed abbiamo dimostrato che questa tecnologia può essere applicata per regolare l'espressione genica e l'ambiente della cromatina in un locus di reporter in modo dose-dipendente e reversibile. In Figura 1, un modello del piombo CEM, CEM23, si vede. Macchinari HDAC sono reclutato per il locus reporter dall'inibitore HDAC che, in questo caso, è il reporter GFP inserito a livello del locus Oct4 .

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Discussion

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Qui, abbiamo descritto il sistema CEM recentemente sviluppato applicato per regolare l'espressione genica e ambiente di cromatina a un gene specifico in modo dose-dipendente. Forniamo un metodo accurato per studiare le dinamiche coinvolte nella regolazione dell'espressione genica attraverso il reclutamento selettivo di proteine regolatrici della cromatina endogeno specifico. Si tratta di una tecnologia altamente modulare che può essere applicata per studiare come le diverse proteine - e cromatina-modificando complessi fu.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

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Gli autori vorrei ringraziare i membri dei laboratori Hathaway e Jin per le loro discussioni utili. Gli autori ringraziano anche Dan Crona e Ian MacDonald per loro lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Grant R01GM118653 da US National Institutes of Health (a N.A.H.); e di sovvenzioni R01GM122749, R01CA218600 e R01HD088626 da l'US National istituti di salute (per J.J.). Questo lavoro è stato supportato anche da un tier 3 e uno studente concedere da UNC Eshelman Istituto per l'innovazione (per N.A.H e A.M.C, rispettivamente). Finanziamenti aggiuntivi da un GM007092 di T-32 (al A.M.C) sostenuto questo lavoro. Dati di citometria a fl....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMCorning10-013CV
NEAAGibco11140-050
HEPES (per coltura tissutale)Corning25-060-Cl
BME (2-Mercaptoetanolo)Gibco21985-023
FBSAtlantic BiologicalsS11550Lotti individuali testati per la qualità
delle provetteCovarisThermoScientificC4008-632R
Covaris capsThermoScientificC4008-2A
PEI (polietilenimmina)Polysciences23966-1
Mezzi di trasfezione (Opti-mem)GibcoCoulter
344058
Membrana filtrante VirusCorning431220
PolybreneSanta Cruz BiotechnologySC134220
0,25 % TripsinaGibco25200-056con
EDTA 0,05 % TripsinaGibco25400-054con EDTA
PuromicinaInvivoGenant-pr
BlasticidinaInvivoGenant-bl
SYBR Green Master Mix (colorante cianina asimmetrico)Roche4913914001
Anticorpo H3K27acAbcamab4729
(kit ChIP) Kit ad alta sensibilità ChIP-ITMotivo attivo53040
SonicatoreCovarisE110
UltracentrifugaOptimaXPN-80
SW-32 rotore per centrifugaBeckman Coulter14U4354
Secchi per centrifuga SW-32 TiBeckman Coulter130.2
LentiX 293 Rene embrionale umanoClontech632180
PBSCorning46-013-CM
BSAFisherBP9700
EGTASigmaE3889
EDTAFisherS311-100
NaClFisherS271-1
GliceroloFisherG33-1
TrisFisherBP152
NP40Roche11754599001
TritonMP Biomedicals807426
GlicinaFisherBP381-500
TE tamponeFisherBP2474-1
HEPES (per ChIP)FisherBP310-100
GelatinaSigmaG1890
Citometro a flusso, Attune NxTThermo FisherA24858
FKBP-Gal4 plasmideAddgene44245
psPAX2 plasmideAddgene12260
pMD2.G plasmideAddgene12259
NanodropletsMegaShearN/A
DNA Nanodrop ThermoFisherND1000
Inibitori della proteasi (leupeptina)Calbiochem/EMD108975
Inibitori della proteasi (chimostatina)Calbiochem/EMD230790
Inibitori della proteasi (pepstatina)Calbiochem/EMD516481
CiA:Oct4 mESCIl gentile dono di G. Crabtree
Lif-1C-alfa - produzione di cellule CosIl gentile dono di J. Wysocka
31985070 Virus provette da centrifuga Beckman

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
  2. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
  3. Bannister, A. J., Kouz....

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