Undertrykke gen transskription ved at omdirigere cellulære maskiner med kemiske epigenetiske modifikatorer
Summary
Regulering af kromatin miljø er en afgørende proces kræves for korrekt genekspression. Her, vi beskriver en metode til at kontrollere genekspression gennem ansættelse af ændring af kromatin maskiner i en gen-specifikke og reversibel måde.
Abstract
Regulering af kromatin jordpakning er en vigtig proces, der styrer genekspression i højere eukaryoter. Selvom kromatin jordpakning og genregulering udtryk er almindeligt forstyrret i mange sygdomme, har et locus-specifikke, endogene og reversible metode til at studere og kontrollere disse virkningsmekanismer manglet. For at løse dette problem, har vi udviklet og karakteriseret roman gen-regulerende bifunctional molekyler. En del af den bifunctional molekyle binder sig til en DNA-protein anker så at det vil blive ansat til en allel-specifik locus. Anden komponenten engagerer endogene cellulære ændring af kromatin maskiner, rekruttere disse proteiner til et gen af interesse. Disse små molekyler kaldet kemisk epigenetiske modifikatorer (CEMs), er i stand til at kontrollere genekspression og kromatin miljø i en dosisafhængig og reversibel måde. Vi detalje her, en CEM tilgang og dens anvendelse til at formindske genekspression og Histon hale acetylation på en grøn fluorescerende proteiner (NGL) reporter beliggende på Oct4 locus i mus embryonale stamceller (mESCs). Vi karakteriserer føringen CEM (CEM23) ved hjælp af fluorescerende mikroskopi, flowcytometri og kromatin immunoprecipitation (ChIP), efterfulgt af en kvantitativ Polymerasekædereaktionen (qPCR). Mens styrken af dette system er demonstreret på locus Oct4 begrebsmæssigt, CEM-teknologi er modulopbygget og kan anvendes i andre celletyper og på andre genomisk loci.
Introduction
Kromatin består af DNA snoet omkring Histon octamer proteiner, der danner kernen nucleosome partikel. Regulering af kromatin jordpakning er en helt nødvendig mekanisme for ordentlig DNA reparation, replikering og udtryk1,2,3. En måde hvorpå celler styre niveauet af jordpakning er gennem tilføjelse eller fjernelse af forskellige posttranslationelle Histon hale ændringer. To sådanne ændringer omfatter (1) lysin acetylation, som er oftest forbundet med genaktivering, og (2) lysin methylering, som kan være forbundet med enten genaktivering eller undertrykkelse, afhængigt af konteksten aminosyre. Tilføjelsen af acetylation og methylering varemærkerne er katalyseret af Histon acetyltransferases (hatte) og Histon methyltransferases (HMTs), henholdsvis, der henviser til, at fjernelse af mærket er udført af Histon deacetyltransferase (HDAC’er) og Histon demethylases (P550 ), henholdsvis4,5. Selv om eksistensen af disse proteiner har været kendt i årtier, mange mekanismer af hvordan ændring af kromatin maskiner værker til korrekt regulere genekspression fortsat være defineret. Da kromatin lovgivningsprocesser er dysregulated i mange menneskelige sygdomme, kunne nye mekanistiske indblik føre til fremtidig terapeutisk anvendelse.
Kromatin i vivo assay (CiA) er en nylig beskrevet teknik, der bruger et kemisk inducer af nærhed (CIP) til at styre ændring af kromatin maskiner rekruttering til en specifik locus6. Denne teknologi har været brugt til at studere en voksende liste af kromatin dynamics, herunder ændring af Histon proteiner, kromatin remodelers og transskription faktorer6,7,8,9. CIP-baserede kromatin tøjring af eksogent udtrykte proteiner har også forlænget forbi CiA til at modulere ikke-modificerede genetiske loci ved brug med en deaktiveret grupperet regelmæssigt Interspaced korte palindromiske gentager CRISPR-forbundet protein (dCas9) 10 , 11. i CiA-systemet, mESCs er blevet ændret for at give udtryk for en normal god landbrugspraksis reporter gen i Oct4 locus, et stærkt udtryk og strengt regulerede område af mESC genom. Tidligere, dette system er blevet anvendt til at beskrive dosisafhængig og reversible ansættelse af eksogent udtrykt heterochromatin protein 1 (HP1), et enzym, der binder H3K9me3 og overfører repressive mærker (f.eks.H3K9me3) og DNA methylering6. For at opnå denne form for rekruttering strategi, er mESCs inficeret med et plasmid, der udtrykker en FK506-bindende protein (FKBP) forbundet til en Gal4, som er en DNA-protein anker, der binder sig til en Gal4-binding array opstrøms af normal god landbrugspraksis reporter. Cellerne er også smittet med en FKBP-rapamycin-bindende domæne (FRB) forbundet til HP1. Når mESCs udsættes for lav nanomolar koncentrationer af CIP, rapamycin, både FRB og FKBP, er bragt sammen på target locus. Inden for dage af rapamycin behandling, udtryk for mål-genet er undertrykt, som det fremgår af Fluorescens mikroskopi og flow flowcytometri og Histon acetylation er faldet, vist af ChIP og bisulfite-sekventering. Mens udviklingen og valideringen af denne tilgang har været betydelige fremskridt inden for kromatin forskning og forordning, en ulempe er det krævede eksogene udtryk for ændring af kromatin maskiner.
For at gøre den teknologi baseret på rekruttering af kun endogene fysiologisk relevante enzymer og gøre en mere modulopbygget system, vi designet og kendetegnet roman bifunctional molekyler, betegnes CEMs (figur 1)12. En komponent i CEMs omfatter FK506, som svarer til rapamycin, bindes stramt og specifikt til FKBP. Således, CEMs vil stadig være ansat til Oct4 locus i CiA mESCs. Anden del af CEMs er en gruppe, der binder endogene ændring af kromatin maskiner. I en pilotundersøgelse testede vi CEMs, der indeholder HDAC-hæmmere. Mens begrebet ved hjælp af en inhibitor for at rekruttere HDAC’er synes counter-intuitive, er inhibitoren ikke desto mindre kan rekruttere HDAC aktivitet til gen af interesse. Dette opnås ved at (1) omdirigere HDAC til locus, frigiver enzymet, og øge tætheden af un-hæmmet HDAC’er i området og (2) opretholder HDAC-hæmning på locus, men rekruttere repressive komplekser, der binder til de hæmmet HDAC’er, eller (3) en kombination af begge. I en tidligere undersøgelse, viste vi, at CEMs var købedygtig med held undertrykke normal god landbrugspraksis reporter på en måde, afhængig af dosis og tidspunkt og på en måde, der var hurtigt reversible (dvs.inden for 24 timer)12. Vi kendetegnet evne til CEM teknologi præsenteres her til kontrol genekspression ved hjælp af Fluorescens mikroskopi, flowcytometri og evnen til at styre kromatin miljø ved hjælp af ChIP-qPCR6. Her, beskriver vi en metode til at bruge og kendetegner CEMs, som vil lette tilpasning af dette system til at besvare yderligere spørgsmål relateret til kromatin biologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, beskrev vi for nylig udviklede CEM systemet anvendes til at regulere genekspression og kromatin miljø på et specifikt gen i en dosisafhængig måde. Vi leverer en præcis metode til at studere dynamikken involveret i reguleringen af genekspression gennem selektiv rekruttering af specifikke endogene kromatin regulerede proteiner. Dette er en yderst modulære teknologi, der kan anvendes til at undersøge, hvordan forskellige protein – og kromatin-ændre komplekser arbejde i koncert til korrekt regulere kromatin milj…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af Hathaway og Jin laboratorierne for deres nyttige diskussioner. Forfatterne også takke Dan Crona og Ian MacDonald for deres kritiske læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet i en del af Grant R01GM118653 fra USA National Institutes of Health (til N.A.H.); og af tilskud R01GM122749, R01CA218600 og R01HD088626 fra det amerikanske nationale institutter for sundhed (til J.J.). Dette arbejde blev også støttet af en tier 3 og en studerende tilskud fra UNC Eshelman Institut for Innovation (N.A.H og A.M.C, henholdsvis). Yderligere finansiering fra en T-32 GM007092 (til A.M.C) støttet dette arbejde. Flow flowcytometri data blev opnået på UNC-Flow flowcytometri Core facilitet finansieret af en P30 CA016086 Cancer Center Core støtte tilskud til UNC-Lineberger Comprehensive Cancer Center.
Materials
| DMEM | Corning | 10-013CV | |
| NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
| BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
| FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
| Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
| Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
| PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
| Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
| Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
| 0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
| 0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
| SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
| H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| (ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
| Sonicator | Covaris | E110 | |
| Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
| SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
| SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
| LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BSA | Fisher | BP9700 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-1 | |
| Tris | Fisher | BP152 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
| Glycine | Fisher | BP381-500 | |
| TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
| HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
| FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
| Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
| DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
| Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
| Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
| Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
| CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
| Lif-1C-alpha – producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |
Riferimenti
- Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
- Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Gräff, J., Tsai, L. -. H. Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
- Hathaway, N. A., et al. Dynamics and memory of heterochromatin in living cells. Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).
- Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes. Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).
- Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin. Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).
- Koh, A. S., Miller, E. L., et al. Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance. Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).
- Chen, T., Gao, D., et al. Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System. Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).
- Braun, S. M. G., et al. Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators. Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).
- Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity. ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).
- Kasoji, S. K., et al. Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath. PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).
- Chiarella, A. M., et al. Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications. Biochimica. 57 (19), 2756-2761 (2018).
- Gao, Y., et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).
