Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Visualisere Axonal vekst kjegle kollaps og tidlig Amyloid β effekter i kulturperler musen nerveceller

Published: October 30, 2018 doi: 10.3791/58229
Automatic Translation
1
1Division of Neuromedical Science, Institute of Natural Medicine, University of Toyama

Summary

Her vises en protokoll for å undersøke tidlig virkningene av amyloid-β (Aβ) i hjernen. Dette viser at Aβ induserer clathrin-mediert endocytose og sammenbruddet av axonal veksten kjeglene. Protokollen er nyttig i å studere tidlig effekter av Aβ på axonal veksten kjeglene og kan lette forebygging av Alzheimers sykdom.

Abstract

Amyloid-β (Aβ) forårsaker minne impairments i Alzheimers sykdom (AD). Selv om therapeutics har vist seg å redusere Aβ nivåer i hjernen til AD pasienter, bedre dette ikke minne. Siden Aβ samler i hjernen før utseendet av minne impairments, kan målretting Aβ være ineffektivt for behandling av AD pasienter som allerede viser minne underskudd. Derfor bør nedstrøms signalisering på grunn av Aβ avsettelse blokkeres før Annonsen utvikling. Aβ induserer axonal degenerasjon, fører til avbrudd i nevrale nettverk og minne impairments. Selv om det er mange studier på mekanismer for Aβ toksisitet, fortsatt kilden til Aβ toksisitet ukjent. For å identifisere kilden, foreslår vi en ny protokoll som bruker mikroskopi, gene transfection og levende celle for å undersøke tidlig endringer forårsaket av Aβ i axonal veksten kjeglene kulturperler neurons. Denne protokollen avslørte at Aβ indusert clathrin-mediert endocytose i axonal veksten kjeglene etterfulgt av vekst kjegle kollaps, demonstrere at hemming av endocytose hindrer Aβ toksisitet. Denne protokollen vil være nyttig i å studere tidlig effekten av Aβ og kan føre til mer effektiv og forebyggende AD behandling.

Introduction

Amyloid-β (Aβ) innskudd finnes i hjernen av pasienter med Alzheimers sykdom (AD) og regnes som en viktig årsak til AD1 som forstyrrer nevrale nettverk, fører til minne impairments2,3,4. Mange klinisk narkotika kandidater har vist seg å effektivt hindre amyloid-β (Aβ) produksjon eller fjerne Aβ innskudd. Men har ingen klart å forbedre minnefunksjon i AD pasienter5. Aβ er allerede deponert i hjernen før utbruddet av minne impairments6; Derfor kan redusere Aβ nivåer i hjernen til pasienter stiller minne impairments være ineffektivt. Aβ avsettelse finnes i preklinisk AD pasienter; men presenterer disse pasientene sjelden neuronal degenerasjon og minne underskudd6. Det er en tidsforsinkelse mellom Aβ avsettelse og minne impairments. Derfor blokkerer en viktig strategi for forebygging av AD Aβ toksisitet signalering i den tidlige fasen av Annonsen, før utviklingen av minne underskudd. Aβ avsettelse induserer axon degenerasjon7,8,9,10,11,12,13, som kan føre til en forstyrrelse av nevrale nettverk og permanent nedskrivninger av minnefunksjon. Mange studier har undersøkt virkningsmekanismer Aβ toksisitet; for eksempel har degenerert axons AD mus hjerner blitt vist å ha økt autophagy14. Calcineurin aktivisering har blitt rapportert som en mulig mekanisme Aβ-indusert axonal degenerasjon15; imidlertid fortsatt direkte avtrekkeren axonal degenerasjon ukjent.

Denne studien fokuserer på sammenbruddet av axonal avslutninger kalt veksten kjeglene. Sammenbruddet av axonal veksten kjeglene kan skyldes axonal vekst repellents, som semaphorin 3A og ephrin-A516,17,18,19,20. Skjul-lignende dystrophic axonal avslutninger er observert i hjernen til AD pasienter21,22. I tillegg kan en svikt i vekst kjegle fungerer provosere axonal degenerasjon23. Men er det ukjent om Aβ induserer vekst kjegle kollaps. Derfor presenterer denne studien en ny protokoll å observere tidlig effekten av Aβ i kulturperler nevroner og undersøke Aβ-indusert vekst kjegle kollaps.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentene ble utført i henhold til veiledning og bruk av forsøksdyr på Sugitani Campus av University of Toyama og ble godkjent av komiteen for Animal Care og bruk av forsøksdyr på Sugitani Campus av den University of Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).

1. kollaps analysen

  1. Poly-D-lysine belegg
    1. Coat 8-brønnen lysbilder med 400 μL 5 μg/mL poly-D-lysine (PDL) i fosfat-bufret saltvann (PBS) og ruge dem på 37 ° C over natten.
    2. Fjerne PDL løsningen og vask brønnene 3 ganger med destillert vann.
  2. Nevron kultur24
    1. Hakke fersk isolert cerebral halvdelene fra embryonale dag 14 (E14) ddY mus med microscissors i Nevron kultur medium inneholder 12% hest serum, 0,6% glukose og 2 mM L-glutamin (middels A). Ikke Legg antibiotika.
      Merk: I denne protokollen, ddY musen brukes. Dette er en outbred belastning brukte i Japan. Denne Nevron kultur protokollen kan også brukes for rotte kortikale nevroner7,25.
    2. Sentrifuge vev 87 x g i 3 minutter.
    3. Fjerne nedbryting. Deretter til pellets, legge 2 mL 0,05% trypsin og ruge i 15 min på 37° C. Bland ved å tappe hver 5 min.
    4. Legge til 4 mL av middels A og blanding ved å trykke.
    5. Sentrifuge vev 178 x g i 3 minutter.
    6. Fjerne nedbryting og ruge vev med 600 U/mL DNase jeg og 0,3 mg/mL soyabønner trypsin hemmer oppløst i PBS i 15 min på 37 ° C. Bland ved å tappe hver 5 min.
    7. Etter inkubasjon Legg 4 mL av middels A og blanding ved å trykke.
    8. Sentrifuge vev 178 x g i 3 minutter.
    9. Etter fjerner nedbryting, Legg 4 mL av medium A og triturate vev med en polert Pasteur pipette.
    10. Filtrere triturated vev med en 70 µm pore-størrelse mesh. Etter filtrering, beregne tettheten av celler med en hemocytometer.
    11. Kultur cellene i 8-vel kulturen Skyv på 0,8 x 104 celler/godt med middels A og opprettholde dem i en CO2 inkubator med en fuktet atmosfære av 10% CO2 på 37 ° C.
    12. Etter 4 h av dyrking, erstatte kultur mellomlang til en inneholder 2% supplement for neuronal kultur, 0,6% glukose og 2 mM L-glutamin (middels B).
      Merk: Renheten av neurons var ca 75%, som beskrevet tidligere26.
  3. Skjul analysen27
    1. Oppløse kommersielt fått full lengde amyloid β1-42 (Aβ1-42) i destillert vann i en konsentrasjon på 0,5 mM og ruge på 37 ° C i 7 dager. Etter inkubasjon, lagre samlede Aβ1-42 løsningen i en fryser for 30 ° C før bruk.
      Merk: Denne inkubasjon er nødvendig for aggregering og toksisitet av Aβ27,28,29,30.
    2. Etter 4 dager med neuronal kultur, behandle brønner med 100 μL nye medium B samlet inneholder 0,5 μM Aβ1-42 eller kjøretøy løsning (destillert vann) på 1 h.
      Merk: Effekter av Aβ1-42 var dose-dependently økt fra 0,1 til 5 μM, og nådde 0,5 μM som beskrevet tidligere27. Lignende resultater kan observeres når ved Aβ1-42 behandling 1t etter 3 dager for neuronal kultur31.
    3. Fjern kultur medium og umiddelbart fastsette neurons med 4% paraformaldehyde som inneholder 4% sukrose i PBS 1t på 37 ° C på en kokeplate.
    4. Etter fiksering, vask neurons 3 ganger med PBS og montere dem med en vandig montering medium. Tørr montering middels på 4 ° C for 2-4 dager.
    5. Ta hele området (7.8 x 9 mm2) hver godt med en 20 X tørr linsen på en invertert mikroskop.
    6. Klassifisere den lengste neurites av hver Nevron i trinn 3 eller 4 som axons, som beskrevet tidligere32,33.
    7. Klassifisere veksten kjeglene i henhold til følgende kriterier: 1) axonal veksten kjeglene mangler lamellipodia eller 2) har færre enn tre filopodia anses kollapset veksten kjeglene, som beskrevet tidligere17.
      Merk: Sunn vekst kjegler scoret som 0; skjulte veksten kjeglene er scoret som 1 poeng. Mener kollaps scoren beregnet for hver behandling.

2. amyloid β Immunostaining

  1. Kultur musen kortikale nevroner i 3 dager, som beskrevet i trinn 1.2.
  2. Behandle med samlede Aβ1-42 (5 μM) eller kjøretøy 4 h på 37 ° C i en CO2 inkubator.
  3. Uten å fjerne mediet, legger en lik mengde 4% paraformaldehyde som inneholder 4% sukrose i PBS hver brønn og opprettholde kulturen på 37 ° C på en varm plate i 5 min.
  4. Erstatte løsningen med 400 μL 4% paraformaldehyde som inneholder 4% sukrose i PBS og vedlikeholde på 37 ° C på kokeplate 1t. Denne fiksering protokollen ble endret fra en tidligere rapport34.
  5. Vask neurons 3 ganger med PBS.
  6. Blokker med 5% normal geit serum i PBS.
  7. Inkuber neurons med musen anti-amyloid β immunglobulin G (IgG) (1:50) og 1% bovin serum albumin i PBS på 4 ° C over natten.
  8. Vask neurons 3 ganger med PBS.
  9. Inkuber neurons med fluorescens-konjugerte sekundære antistoff (1:400) og 1% bovin serum albumin i PBS ved romtemperatur for 2T.
  10. Vask neurons 3 ganger med PBS og montere dem med en vandig montering medium.
  11. Fange fluorescens bilder og lys feltet bilder skrå belysning ved hjelp av en 40 X tørr linsen på invertert mikroskop B.

3. axonal immunostai-27

  1. Vask neurons 3 ganger med PBS etter kulturperler Nevron fiksering, som beskrevet i trinn 1.3.3.
  2. Inkuber neurons med musen anti-tau-1 IgG (1:500), kanin anti-microtubule tilknyttet protein 2 (MAP2) IgG (1:500) i 5% normal geit serum og 0,3% t- octylphenoxypoly-ethoxyethanol i PBS på 4 ° C over natten.
  3. Vask neurons 3 ganger med PBS.
  4. Inkuber neurons med fluorescens-konjugerte sekundære antistoffer (1:400) og 0,3% t- octylphenoxypolyethoxyethanol i PBS ved romtemperatur for 2T.
  5. Vask neurons 3 ganger med PBS, og monteres med en vandig montering medium.
  6. Ta fluorescens og differensial forstyrrelser kontrast (DIC) bilder ved hjelp av en 20 × tørr linsen på invertert mikroskop A.

4. levende celle Imaging27

  1. Pels glass-basert retter med 500 μL PDL (5 μg/mL), som beskrevet i trinn 1.1.1.
    Merk: I denne protokollen, hjemmelaget glass-baserte retter ble brukt. Kommersielt tilgjengelige glass-baserte retter kan også brukes til live bildebehandling. Hjemmelaget glass-baserte retter ble utarbeidet som følger: 1) lage et hull ca 1.4 mm i diameter i midten av en 35 mm rett med hånden punch og 2) feste et glass dekkglassvæske (diameter 22 mm) på baksiden av parabolen med silikon.
  2. Vask platene med destillert vann, som beskrevet i trinn 1.1.2, og kultur kortikale neurons i glass-basert retten på 3 x 104 celler/parabolen med middels A, som beskrevet i trinn 1.2.
  3. Etter 4 dager med cellekulturer, erstatte mediet med 2 mL nytt medium B og overføring invertert parabolen med mikroskop A. vedlikeholde kulturen i et fuktet 10% CO2 på 37 ° C.

5. endocytose eksperiment

  1. Kultur musen kortikale neurons som beskrevet i trinn 1.2.
  2. Fire dager senere, Erstatt medium med 100 μL nytt medium B inneholder 20 μM fluorescens membran undersøke for 1 min.
  3. Tilsett 1 μL 0.05 mM samlede Aβ1-42 (siste 0,5 μM) eller kjøretøy (destillert vann) løsning og blanding av pipettering. Inkuber for 20 min.
  4. Fjerne mediet og vask brønnene to ganger med medium B som har vært forvarmes til 37 ° C.
  5. Fastsette, vask og montere neurons som beskrevet i trinn 1.3.3 og 1.3.4.
  6. Fange fluorescerende og DIC bilder med en 63 X olje linsen på invertert mikroskop A.
  7. Kvantifisere tettheten av området fluorescens membran probe-positive i hver sunn vekst membran ved hjelp av en programvare.

6. gen Transfection

  1. Forberede kortikale nevroner som beskrevet i trinn 1.2. Etter fullført trinnene 1.2.1 til 1.2.10, sentrifuge neurons 178 x g i 3 minutter.
  2. Fjern nedbryting, legge 4 mL av Ca2 +-gratis og Mg2 +-gratis Hanks' balansert salt løsning (CMF-HBSS), og blande av pipettering.
  3. Sentrifuge cellene på 178 x g i 3 minutter.
  4. Fjerne nedbryting, legge 4 mL CMF-HBSS og blande av pipettering. Deretter beregne celle tetthet, som beskrevet i trinn 1.2.10.
  5. Overføre 5 x 106 celler til en 1,5 mL rør og sentrifuge 1,677 x g for 1 min.
  6. Fjerne nedbryting, tilsett 100 μL transfection løsning med supplement og 3 μg av DNA plasmider koding EGFP eller EGFP-AP180 C-terminus og blande av pipettering.
  7. Overføre ovenstående løsning (trinn 6.6) til sertifisert søppel og transfect med en electroporator, i henhold til produsentens protokollen.
  8. Umiddelbart etter hva, legge til 500 μL medium A i cuvette og overføre løsningen til en 1.5-mL tube med en sertifisert pipette. Deretter beregne celle tetthet, som beskrevet i trinn 1.2.10.
  9. Kultur cellene i en 8-brønnen lysbilde 0.8 x 104 celler/Vel, som beskrevet i trinn 1.2.11 og 1.2.12.
  10. Etter 4 dager med cellekulturer, utføre en kollaps analysen som beskrevet i trinn 1.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne protokollen, ble Aβ1-42 inkubert på 37 ° C i 7 dager før bruk fordi inkubasjonstiden for Aβ1-42 var nødvendig for å produsere toksiske formene27,28,30,35. Etter denne inkubasjon ble aggregert former for Aβ observert (figur 1A). Det har blitt rapportert at lignende inkubasjonstiden for Aβ1-42 produsert fibril form av Aβ36. Etter behandling med denne samlede Aβ1-42, immunostaining med et antistoff for de giftige oligomer på Aβ35,37 ble utført, og positiv flekker ble oppdaget på kulturperler neurons (figur 1B). Tatt i betraktning ovennevnte produserer denne inkubasjon protokollen de giftige formene for Aβ.

Dagene var nødvendig for induksjon av axonal degenerasjon etter Aβ eksponering. Hendelsene før axonal degenerasjon fortsatt uklare. Derfor er denne protokollen utviklet for ytterligere å forstå mekanismene som er involvert. Bruker denne protokollen, ble tidlig fenomener av Aβ behandling analysert. Kortikale nevroner ble kultivert for 4 dager. De lengste neurites i kulturperler nervecellene ble identifisert som axons; Dette ble bekreftet av positiv immunostaining for axonal markør, tau-1 og negative immunostai-for dendrittiske markøren, MAP2 (figur 2). Etter 1 h kjøretøy behandling, hadde veksten kjeglene spredt lamellipodia og behandlet flere filopodia. Dette ble identifisert som sunn vekst kjegler. Derimot 1t Aβ1-42 behandling førte til krympet veksten kjeglene, som utviklet ingen lamellipodia eller filopodia. Dette ble identifisert som skjulte veksten kjeglene. Skjul score ble beregnet som beskrevet i trinn 1.3.7. Når figurer av veksten kjeglene var uklart, ble de eliminert fra analysen. Aβ1-42 behandling førte til en betydelig økning i Skjul score, tilsvarer økt axonal vekst kollaps, sammenlignet med sammenbruddet poengsummen for kjøretøy-behandlet veksten kjeglene27.

Axonal veksten kjeglene ble observert før og etter behandling med Aβ1-42 (Figur 3). Cellene ble opprettholdt i det inverterte mikroskopet med en fuktet atmosfære av 10% CO2 på 37 ° C. Bildene ble tatt hver 5 min. Som vist i Figur 3, kollapset veksten kjeglene mellom 21 og 26 min etter Aβ1-42 behandling. Veksten kjeglene ble ekskludert fra levende celle imaging hvis de ikke gjorde beholde sin sunne form 1t før behandling.

For å visualisere tidlig effekten av Aβ1-42-behandling, ble endocytose brukt som fokus for denne analysen, fordi endocytose hemmere kan blokkere Aβ1-42-indusert vekst-membran kollaps27. Endocytose var visualisert med en fluorescens membran sonde (i.e., et lysstoffrør fargestoff som binder seg til plasma membraner og er spontant endocytosed). En tidligere studie viste at veksten kjeglene ikke skjules 20 minutter etter Aβ1-42-behandling27; Derfor ble sunn vekst kjegler valgt av DIC imaging kjøretøy - eller Aβ1-42-behandlet celler etter 20 min. Etter Aβ1-42-behandling, mange fluorescerende membran probe-positive puncta ble observert i vekst membran (Figur 4). Tettheten av fluorescens membran probe-positive puncta i veksten kjeglene var betydelig økt27. Dette tyder på at Aβ1-42-indusert vekst kjegle endocytose oppstår før sammenbruddet.

For å bekrefte rollen endocytose, en DNA plasmider koding EGFP-AP180 C-terminus var transfekterte i kulturperler kortikale nevroner. Celler som uttrykker AP180 C-terminus selektivt hemmet clathrin-mediert endocytose38,39. Hvis EGFP uttrykket ble observert på celle kroppen i Nevron, AP180 C-terminus ble betraktet som å bli uttrykt på axonal vekst membran av Nevron. Hva med AP180 C-terminus blokkert Aβ1-42-indusert vekst kjegle sammenbruddet (figur 5)27.

Figure 1
Figur 1 : Inkubasjon av Β1-42 samler Aβ. (A) Aβ1-42 ble oppløst i destillert vann i en konsentrasjon på 0,5 mM og ruges på 37 ° C i 7 dager (etter inkubasjon) eller lagret på 30 ° C uten inkubering (ingen inkubasjon). Hver Aβ løsning ble utvannet 0,1 mm; deretter ble 10 μL av hver utvannet løsning droppet på glass lysbilder og dekket med coverslips. Bright-feltet bilder med skrå belysning ble fanget ved hjelp av invertert mikroskop B. skala bar = 20 μm. (B) samlet Aβ1-42 eller kjøretøy behandling på kulturperler neurons 4 h. Etter behandling, neurons ble løst og immunostained for giftige Aβ oligomers. Fluorescens bilder (rød) og lys-feltet bilder med skrå belysning (grå) vises. Skala bar = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : A Β1-42-indusert axonal vekst kjegle kollaps. Etter Aβ1-42 - eller kjøretøy-behandling, nerveceller ble løst og immunostained for tau-1 (rød) og microtubule tilhørende protein 2 (MAP2, grønn). Fluorescens og differensial forstyrrelser kontrast (DIC) bilder vises. Forstørrede visninger av regioner av interesse (ROI, rektangler) vises under deres tilsvarende bilder. Hvit skala barer = 50 μm; svart skala barer = 10 μm. Dette tallet er endret fra Kuboyama et al, 201527. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Live cell imaging før og etter Β1-42 behandling. Etter 4 dager av kultur, celler ble overført til en invertert mikroskop og DIC bilder ble tatt hver 5 min. Time-lapse bilder vises. Tallene representerer minutter: sekunder etter samlede Aβ1-42 (siste konsentrasjon, 0,5 μM). Skala bar = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Tjue minutter av Β1-42 behandling indusert endocytose. Kortikale nevroner kulturperler i 4 dager og behandlet med en fluorescens membran sonde. Deretter ble neurons behandlet for 20 min med Aβ1-42 eller kjøretøy. Fluorescens bilder av veksten kjeglene vises. De gule prikkete representerer konturene av veksten kjeglene. Skala bar = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Uttrykk for AP180-C-terminus blokkerer Aβ1-42-indusert kollaps. Fire dager etter hva EGFP (A, B) eller EGFP-AP180 C-terminus (C, D); Aβ1-42 (B, D) eller kjøretøy (A, C) ble lagt til kortikale nevroner for 1 h. DIC (øvre panel) og fluorescens (bunnen panel) bilder vises. Pilene angir veksten kjeglene. Skalere barer = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet i denne studien aktivert observasjon av tidlig fenomener i axonal veksten kjeglene etter Aβ1-42 behandling. Aβ1-42 indusert endocytose i axonal veksten kjeglene innen 20 min, og vekst kjegle kollaps ble observert i 1t behandling. Denne endocytose var sannsynligvis formidlet av clathrin. Bruker denne protokollen, ble hemming av clathrin-mediert endocytose bekreftet for å hindre Aβ1-42-indusert vekst kjegle kollaps og axonal degenerasjon i kulturperler neurons27. I tillegg svekket hemming av clathrin-mediert endocytose Aβ1-42-indusert axonal degenerasjon og minne underskudd i vivo27. Disse resultatene indikerer at clathrin-mediert endocytose er en lovende terapeutiske avenue for AD forebygging.

Denne protokollen ble utviklet fra skjule analyser for axonal vekst repellents, som semaphorin 3A og ephrin-A516,17,18,19,20. Skjul analyser har blitt brukt i studier vurdere utviklingen av nevrale nettverk. Jeg har vist at denne protokollen kan brukes til patologisk analyser, spesielt de som involverer mekanismer for annonse; en begrensning kan imidlertid være at ca 40% av veksten kjeglene kollapset i sunne tilstand. Denne prosentandelen er høyere enn resultater fra kulturperler dorsal root ganglion neurons, som er mer vanlig i Skjul analyser16,17,18,19,20. Forskjellen i celletyper kan derfor knyttes til forskjeller i Skjul prosenter. Skjul forholdstallene i denne studien var i samsvar med de som finnes i tidligere studier med normal kulturperler kortikale nevroner40,41. Videre indusert Aβ1-42 lignende nivåer av vekst kjegle kollaps sammenlignet med andre kollaps faktorer, som semaphorin 3A og ephrin-A527. Derfor er denne protokollen gyldig for kvantifisering av Aβ1-42-indusert vekst kjegle kollaps. Denne fiksering protokollen er viktig å opprettholde form av veksten kjeglene. Hvis cellene er konvensjonelt løst med 4% paraformaldehyde i romtemperatur, kan flere veksten kjeglene har kollapset på grunn av fiksering prosedyren (data ikke vist). Eventuelt er glutaraldehyde og fiksering buffere tilgjengelig for stive fiksering, som beskrevet tidligere42; imidlertid viser glutaraldehyde autofluorescence, som er et betydelig hinder for fluorescens bildebehandling.

En fersk studie med samme protokoll viste at vann ekstrakt fra Radix Polygalae (røtter av Polygala tenuifolia) hemmet Aβ1-42-indusert endocytose i kulturperler nerveceller, forhindret axonal degenerasjon, og redusert hukommelse underskudd i en transgene musemodell av AD31. En roman kandidat for AD forebygging har blitt funnet med denne protokollen. En kombinasjon av genet transfection og levende celle imaging i denne protokollen kan vise andre cellulære hendelser funnet i axons og deres terminaler før og etter Aβ behandling, som Ca2 + bildebehandling, microtubule dynamics og celle vedheft dynamikk, som er angivelig knyttet til axonal vekst43,44,45. Dette kan bidra til å avsløre mer detaljert mekanismer Aβ toksisitet og kan lede til forebygging og/eller behandling av Annonsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet av forskningsmidler fra JSP (KAKENHI 18K 07389), Japan, Takeda Science Foundation, Japan og Kobayashi farmasøytiske co, Ltd, Japan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ddY mice SLC
Eight-well culture slide Falcon 354108
poly D lysine Wako 168-19041
Culture medium, Neurobasal medium Gibco 21103-049
house serum Gibco 26050-088
glucose Wako 049-31165
L-glutamine Wako 074-00522
0.05% trypsin Gibco 25300-054
DNase I Worthington DP
soybean trypsin inhibitor Gibco 17075-029
Filter with 70 µm mesh size, cell strainer Falcon 352350
B-27 supplement Gibco 17504-044
CO2 incubator Astec SCA-165DS
Amyloid β1-42 Sigma-Aldrich A9810
paraformaldehyde Wako 162-16065
sucrose  Wako 196-00015
Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount polysciences 18606-20
Inverted microscope A Carl Zeiss Axio Observer Z1  Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1
Objective Plan-Apochromat 20x Carl Zeiss 420650-9901
Objective Plan-Apochromat 63x Carl Zeiss 440762-9904
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X Nikon
anti-MAP2 IgG Abcam ab32454
anti-tau-1 IgG Chemicon MAB3420
anti-amyloid β antibody IBL 10379 clone 11A1
normal goat serum Wako 143-06561
bovine serum albumin Wako 010-25783
t-octylphenoxypolyethoxyethanol Wako 169-21105
goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 Invitrogen A11032
goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 Invitrogen A11029
hot plate NISSIN NHP-M30N
cover glass Fisher Scientific 12-545-85
35 mm dish IWAKI 1000-035
Silicone RTV Shin-Etsu KE42T
hand punch Roper Whitney No. XX
Fluorescence membrane probe, FM1-43FX Invitrogen F35355
Ca2+- and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution Gibco 14175-095
Transfection solution, Nucleofector solution Lonza VPG-1001
Electroporator, Nucleofector I Amaxa
Inverted microscope B Keyence BZ-X710
Image software, ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic changes in Alzheimer's disease. Neuroscience. 105 (1), 99-107 (2001).
  3. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  4. Perl, D. P. Neuropathology of Alzheimer's disease. Mount Sinai Journal of Medicine. 77 (1), 32-42 (2010).
  5. Graham, W. V., Bonito-Oliva, A., Sakmar, T. P. Update on Alzheimer's Disease Therapy and Prevention Strategies. Annual Review of Medicine. 68, 413-430 (2017).
  6. Jack, C. R. Jr, et al. Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer's pathological cascade. Lancet Neurology. 9 (1), 119-128 (2010).
  7. Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Neuritic regeneration and synaptic reconstruction induced by withanolide A. British Journal of Pharmacology. 144 (7), 961-971 (2005).
  8. Tohda, C., Urano, T., Umezaki, M., Nemere, I., Kuboyama, T. Diosgenin is an exogenous activator of 1,25D3-MARRS/Pdia3/ERp57 and improves Alzheimer's disease pathologies in 5XFAD mice. Scientific Reports. 2, 535 (2012).
  9. Jawhar, S., Trawicka, A., Jenneckens, C., Bayer, T. A., Wirths, O. Motor deficits, neuron loss, and reduced anxiety coinciding with axonal degeneration and intraneuronal Abeta aggregation in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 33 (1), e129-e140 (2012).
  10. Postuma, R. B., et al. Substrate-bound beta-amyloid peptides inhibit cell adhesion and neurite outgrowth in primary neuronal cultures. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1122-1130 (2000).
  11. Tohda, C., Nakada, R., Urano, T., Okonogi, A., Kuboyama, T. Kamikihi-to (KKT) rescues axonal and synaptic degeneration associated with memory impairment in a mouse model of Alzheimer's disease, 5XFAD. International Journal of Neuroscience. 121 (12), 641-648 (2011).
  12. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature Neuroscience. 7 (11), 1181-1183 (2004).
  13. Wirths, O., Weis, J., Kayed, R., Saido, T. C., Bayer, T. A. Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model. Neurobiology of Aging. 28 (11), 1689-1699 (2007).
  14. Sanchez-Varo, R., et al. Abnormal accumulation of autophagic vesicles correlates with axonal and synaptic pathology in young Alzheimer's mice hippocampus. Acta Neuropathologica. 123 (1), 53-70 (2012).
  15. Wu, H. Y., et al. Amyloid beta induces the morphological neurodegenerative triad of spine loss, dendritic simplification, and neuritic dystrophies through calcineurin activation. Journal of Neuroscience. 30 (7), 2636-2649 (2010).
  16. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32 (6), 1013-1026 (2001).
  17. Jurney, W. M., Gallo, G., Letourneau, P. C., McLoon, S. C. Rac1-mediated endocytosis during ephrin-A2- and semaphorin 3A-induced growth cone collapse. Journal of Neuroscience. 22 (14), 6019-6028 (2002).
  18. Luo, Y., Raible, D., Raper, J. A. Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones. Cell. 75 (2), 217-227 (1993).
  19. Nicol, X., Muzerelle, A., Rio, J. P., Metin, C., Gaspar, P. Requirement of adenylate cyclase 1 for the ephrin-A5-dependent retraction of exuberant retinal axons. Journal of Neuroscience. 26 (3), 862-872 (2006).
  20. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
  21. Benes, F. M., Farol, P. A., Majocha, R. E., Marotta, C. A., Bird, E. D. Evidence for axonal loss in regions occupied by senile plaques in Alzheimer cortex. Neuroscience. 42 (3), 651-660 (1991).
  22. Masliah, E., et al. An antibody against phosphorylated neurofilaments identifies a subset of damaged association axons in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 142 (3), 871-882 (1993).
  23. Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1473), 1575-1592 (2006).
  24. Teshigawara, K., et al. A novel compound, denosomin, ameliorates spinal cord injury via axonal growth associated with astrocyte-secreted vimentin. British Journal of Pharmacology. 168 (4), 903-919 (2013).
  25. Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Withanoside IV and its active metabolite, sominone, attenuate A beta(25-35)-induced neurodegeneration. European Journal of Neuroscience. 23 (6), 1417-1426 (2006).
  26. Tanabe, N., Kuboyama, T., Tohda, C. Matrine Directly Activates Extracellular Heat Shock Protein 90, Resulting in Axonal Growth and Functional Recovery in Spinal Cord Injured-Mice. Frontiers in Pharmacology. 9 (446), (2018).
  27. Kuboyama, T., Lee, Y. A., Nishiko, H., Tohda, C. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis prevents amyloid beta-induced axonal damage. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1808-1819 (2015).
  28. Pike, C. J., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. In vitro aging of beta-amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity. Brain Research. 563 (1-2), 311-314 (1991).
  29. Uchida, N., et al. Yokukansan inhibits social isolation-induced aggression and methamphetamine-induced hyperlocomotion in rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 32 (3), 372-375 (2009).
  30. Pike, C. J., Burdick, D., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. Neurodegeneration induced by beta-amyloid peptides in vitro: the role of peptide assembly state. Journal of Neuroscience. 13 (4), 1676-1687 (1993).
  31. Kuboyama, T., Hirotsu, K., Arai, T., Yamasaki, H., Tohda, C. Polygalae Radix Extract Prevents Axonal Degeneration and Memory Deficits in a Transgenic Mouse Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in Pharmacology. 8, 805 (2017).
  32. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  33. Arimura, N., Kaibuchi, K. Neuronal polarity: from extracellular signals to intracellular mechanisms. Nature Reviews: Neuroscience. 8 (3), 194-205 (2007).
  34. De Felice, F. G., et al. Alzheimer's disease-type neuronal tau hyperphosphorylation induced by A beta oligomers. Neurobiology of Aging. 29 (9), 1334-1347 (2008).
  35. Izuo, N., et al. Toxicity in Rat Primary Neurons through the Cellular Oxidative Stress Induced by the Turn Formation at Positions 22 and 23 of Aβ42. ACS Chemical Neuroscience. 3 (9), 674-681 (2012).
  36. Fujiwara, H., et al. Uncaria rhynchophylla, a Chinese medicinal herb, has potent antiaggregation effects on Alzheimer's beta-amyloid proteins. Journal of Neuroscience Research. 84 (2), 427-433 (2006).
  37. Murakami, K., et al. Monoclonal antibody against the turn of the 42-residue amyloid beta-protein at positions 22 and 23. ACS Chemical Neuroscience. 1 (11), 747-756 (2010).
  38. Ford, M. G., et al. Simultaneous binding of PtdIns(4,5)P2 and clathrin by AP180 in the nucleation of clathrin lattices on membranes. Science. 291 (5506), 1051-1055 (2001).
  39. Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66 (3), 370-377 (2010).
  40. Ahmed, G., et al. Draxin inhibits axonal outgrowth through the netrin receptor DCC. Journal of Neuroscience. 31 (39), 14018-14023 (2011).
  41. Brennaman, L. H., Moss, M. L., Maness, P. F. EphrinA/EphA-induced ectodomain shedding of neural cell adhesion molecule regulates growth cone repulsion through ADAM10 metalloprotease. Journal of Neurochemistry. 128 (2), 267-279 (2014).
  42. Tojima, T., et al. Attractive axon guidance involves asymmetric membrane transport and exocytosis in the growth cone. Nature Neuroscience. 10 (1), 58-66 (2007).
  43. Ooashi, N., Futatsugi, A., Yoshihara, F., Mikoshiba, K., Kamiguchi, H. Cell adhesion molecules regulate Ca2+-mediated steering of growth cones via cyclic AMP and ryanodine receptor type 3. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1159-1167 (2005).
  44. Biswas, S., Kalil, K. The Microtubule-Associated Protein Tau Mediates the Organization of Microtubules and Their Dynamic Exploration of Actin-Rich Lamellipodia and Filopodia of Cortical Growth Cones. Journal of Neuroscience. 38 (2), 291-307 (2018).
  45. Kuboyama, T., et al. Paxillin phosphorylation counteracts proteoglycan-mediated inhibition of axon regeneration. Experimental Neurology. 248, 157-169 (2013).

Tags

Nevrovitenskap problemet 140 Amyloid β axon vekst kjegle kollaps endocytose live celle bildebehandling
Visualisere Axonal vekst kjegle kollaps og tidlig Amyloid β effekter i kulturperler musen nerveceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuboyama, T. Visualizing Axonal… More

Kuboyama, T. Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid β Effects in Cultured Mouse Neurons. J. Vis. Exp. (140), e58229, doi:10.3791/58229 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter