Isolering av fysiologisk aktiv Thylakoids og deres bruk i energi avhengig av Protein Transport analyser
Summary
Vi presenterer protokoller her for høy avkastning isolering av fysiologisk aktiv thylakoids og protein transport analyser for chloroplast twin arginine translokasjon (cpTat), sekretoriske (cpSec1) og signal anerkjennelse partikkel (cpSRP) stier.
Abstract
Chloroplasts er organelles i grønne planter ansvarlig for gjennomføring av mange viktige metabolske veier, spesielt fotosyntese. Chloroplasts, thylakoid membran systemet huser alle fotosynteseaktiviteten pigmentene, reaksjon center komplekser og de fleste av elektron bærere og er ansvarlig for lys-avhengige ATP syntese. Over 90% av chloroplast proteiner er kodet i kjernen, oversatt i stoffer, og deretter importeres til chloroplast. Ytterligere protein transport i eller over thylakoid membranen benytter en av fire translokasjon. Her beskriver vi en høy dekkevne metode for isolering av transport-kompetent thylakoids fra erter (Parlamentarisme sativum), samt transport analyser gjennom tre energi avhengig av cpTat, cpSec1 og cpSRP-mediert trasé. Disse metodene at eksperimenter vedrørende thylakoid protein lokalisering og transport energi mekanismer av protein translokasjon over biologiske membraner.
Introduction
Nesten alle proteinaceous maskiner ansvarlig for riktig chloroplast-funksjonen må være translocated fra stoffer1. På chloroplast konvoluttene importeres protein underlag gjennom translocon av den ytre membranen (Innholdsfortegnelsen) og translocon av indre membran (TIC)2. Videre målretting for thylakoid skjer membran og lumen gjennom twin arginine translokasjon (cpTat)3, sekretoriske (cpSec1)4, signalet anerkjennelse partikkel (cpSRP)5og spontan innsetting veier6 . En metode for høy avkastning isolering av fysiologisk aktive chloroplasts og thylakoid membraner er nødvendig for å måle energi og kinetics av en translokasjon hendelse, forstår de forskjellige transportmekanismene i hver veien og lokalisere en spesielle proteinet substrat av interesse for noen av de seks forskjellige avdelinger av chloroplast.
Isolasjon av membraner fra chloroplast gir bedre eksperimentelle kontroll over miljøfaktorer (for eksempel salt og underlaget konsentrasjoner, ATP/GTP, og pH forhold) som påvirker måling av transport energi og Kinetics. Dette i vitro miljø gir seg til utforskning av mekanistisk detaljer om translokasjon av samme grunn. I tillegg, mens prognosen programvare for lokalisering av chloroplast proteiner har forbedret7,8, gir i vitro transport analyser en raskere metode for bekreftelse over mikroskopi-baserte fluorescerende analyser som kreve en genetisk kodet fluorescerende kode, plante transformasjon og/eller spesifikke antistoffer. Her presenterer vi protokoller for chloroplast og thylakoid isolasjoner fra erter (Parlamentarisme sativum) og transport analyser optimalisert for hver av energi-avhengige thylakoid translokasjon veier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chloroplast og Thylakoid isolasjon
Overdreven brudd kan resultere i dårlig chloroplast isolasjon og dårlig thylakoid kapasitet etter separasjonen i forløpningen. Det er best å homogenize høstet vevet forsiktig ved å sikre at alt materiale er neddykket før blanding og pulserende i 15 s sykluser til fullt homogenisert. Om nødvendig kan du bruke flere kortere runder blanding med mindre vev i hver runde.
Kjøle alle materialer som kommer i kontakt med høstet vev h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette manuskriptet var forberedt med finansiering av Division of kjemiske Sciences, Geofag og biovitenskap, 408 kontoret til energi basalfag av oss Department of Energy gjennom Grant DE-SC0017035
Materials
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
References
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. Protein transport into chloroplasts. Annual review of plant biology. 61, (2010).
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. . Plastid Biology. , 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. . Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
