Summary
本文提出了用于叶绿体双精氨酸易位 (cpTat)、分泌 (cpSec1) 和信号识别粒子 (cpSRP) 通路的生理活性类囊体和蛋白质转运测定的高产量隔离的协议。
Abstract
叶绿体是绿色植物中的细胞器, 负责执行许多必要的代谢通路, 尤其是光合作用。在叶绿体内, 类囊体膜系统将所有的光合颜料、反应中心配合物和大多数电子载体都安置在一起, 并负责光依赖性 ATP 的合成。90% 以上的叶绿体蛋白被编码在细胞核中, 翻译成细胞质, 随后导入叶绿体。进一步蛋白质运输入或横跨囊状体膜利用四个易位途径之一。在这里, 我们描述了一个高产的方法, 以分离的运输主管类囊体从豌豆 (豌豆大蒜), 连同运输化验通过三能源依赖 cpTat, cpSec1 和 cpSRP 介导的途径。这些方法使实验与囊体蛋白定位, 传输能量学, 和蛋白质易位的机制跨生物膜。
Introduction
几乎所有负责适当叶绿体功能的蛋白质机械都必须从细胞质1移位。在叶绿体信封, 蛋白质基质是通过 translocon 的外层膜 (TOC) 和 translocon 的内膜 (TIC)2进口。进一步靶向囊体膜和流明发生通过双精氨酸易位 (cpTat)3, 分泌 (cpSec1)4, 信号识别粒子 (cpSRP)5和自发插入通路6.一种对生理活性叶绿体和类囊体膜进行高产分离的方法, 是测量易位事件的热力学和动力学的必要条件, 了解各途径中不同的传输机制, 并将特定的蛋白质基板感兴趣的六个不同的隔间的叶绿体。
分离的膜从叶绿体提供更好的实验控制环境因素 (如盐和基质浓度, ATP/GTP 的存在, 和 pH 条件), 影响测量的运输热力学和动力学。由于同样的原因, 这种体外环境有利于对易位机械细节的探索。此外, 虽然叶绿体蛋白定位的预测软件改善了7,8,体外传输化验提供了一个更快的方法, 以证实显微镜下的荧光化验,需要基因编码的荧光标记, 植物转化和/或特定的抗体。在这里, 我们提出了从豌豆 (豌豆大蒜) 隔离叶绿体和囊体的协议, 以及为每个能量依赖性囊体易位通路优化的运输化验。
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Protocol
1. 初始材料
- 在400毫升蒸馏水中浸泡大约55克豌豆3小时, 然后在一个塑料托盘 (35 厘米 x 20 厘米 x 6 厘米) 在覆盖着薄薄的蛭石层的土壤中播种。
- 将豌豆的托盘生长在20摄氏度以下12/12 小时/暗 (50 µE/米2s) 周期9至15天。
- 根据首选方法制备蛋白质基质。
注: 我们已经准备了蛋白质基质使用多种方法, 包括 1) 从纯化质粒体外转录, 然后用小麦胚芽提取物或兔网织裂解物在 [3H]-亮氨酸的存在下进行翻译。或 [35S]-蛋氨酸, 2)体外翻译使用一个耦合转录/翻译套件, 如 TnT 套件从完成公司有关, 与 radiolabeling 以上, 和 3) 纯化抗原蛋白的大肠杆菌。放射性的体外翻译产品一般用50毫米冷氨基酸在运输反应前进行淬火。每种方法通常需要对每个新的蛋白质基板进行一些优化。为一个被结合的体外系统的例子, 看见凌和贾维斯 (2016)9。
2. 叶绿体的分离和定量
注: 制备类囊体的第一步是完整的叶绿体10的分离。所有材料在准备过程中应保持冷。叶绿体的泥沙应该轻轻地处理, 因为这一步的破损会严重限制随后的囊体产量。
- 事先准备以下解决方案。
- 2x 研磨缓冲器 (2xGB): 100 毫米 K HEPES pH 值 7.3, 660 毫米山梨醇, 2 毫米氯化镁2, 2 毫米 MnCl2, 4 毫米 EDTA, 0.2% BSA。
- 2x 进口缓冲器 (2xIB): 100 毫米 k Tricine 或 k-HEPES pH 8.0, 660 毫米山梨醇, 8 毫米氯化镁2。
注: 氯化镁2的浓度从3毫米到10毫米不等, 没有明显的差异。
- 准备一个连续的密度梯度通过离心15毫升 Percoll 和15毫升的混合物在 30900 g在一个固定的角度转子为30分钟在4°c 与刹车关闭。
- 收获大约25克9-15 天老豌豆和融汇在95毫升1xGB。有刀片或 Polytron 的搅拌机已成功使用。在漏斗中至少用2层 Miracloth 过滤这种混合物。
注意: 限制茎组织的数量是不必要的, 但可以使均匀化过程更容易, 从而减少可能发生的叶绿体断裂长时间混合。 - 颗粒在 3000克在摆动斗转子5分钟在4°c, 并轻轻并用重悬在1毫升1xGB。画笔可能是最温和的泥沙技术。
- 小心地层数绿色悬浮在顶部 Percoll 梯度和离心机在 8000 g在摇摆的桶式转子为10分钟在4°c 与刹车。
- 小心地收获较低的绿色带, 包含完整的叶绿体进入新鲜的管。旋转的恢复完好的叶绿体在 1800克在摆动斗转子5分钟, 在4摄氏度, 丢弃上清, 并轻轻并用重悬颗粒在1xIB。重复这个洗涤步骤一次, resuspending 在30毫升1xIB 每一次, 与最终泥沙在1毫升1xIB。
- 为了量化叶绿素 (叶绿素) 含量, 混合10µL 完全悬浮叶绿体与5毫升80% 丙酮和过滤通过惠特曼1滤纸 (公称厚度180µm)。在分光光度计中记录 720 nm、663 nm 和 645 nm 的吸收量, 并使用以下公式计算叶绿素浓度:
[智利] 毫克/毫升 = [40.2 * (663 -720) + 101.4 * (645 -720)] * 0。1 - 将叶绿体调整为1毫克/毫升, 相当于1xIB。
3. 类囊体的分离
注: 类囊体是由完整叶绿体的低渗裂解制备而成。这是通过将叶绿体暴露于缺乏山梨醇的低渗缓冲而实现的。分离类囊体可用于测定任何易位通路, 但基质提取物 (SE) 也必须隔离在这一准备过程中, 如果 cpSec1 或 cpSRP 途径进行调查。
- 提前准备以下解决方案。
- 低渗裂解缓冲剂:50 毫米 Tricine 或 k-HEPES pH 值 8.0, 8 毫米氯化镁2。
- 2x. 粗质基质缓冲液 (硒浓度): 100 毫米 K HEPES pH 值 8.0, 660 毫米山梨醇, 8 毫米氯化镁2。
- Laemmli 样品缓冲 (为 SDS 页, 补充 EDTA): 125 毫米三 pH 值 6.8, 10% SDS, 20% 甘油, 0.05 毫克/毫升溴酚蓝色, 10% β-巯基乙醇, 10 毫米 EDTA。
- 如果 SE 恢复不是必要的, 离心机的完整叶绿体在 1000克在摆动斗转子6分钟在4°c。
- 在低渗裂解缓冲液中丢弃上清和并用重悬到1毫克/毫升。在黑暗中的冰上孵化10分钟, 偶尔混合。
- 离心在 3200克的摆动斗转子中恢复类囊体4摄氏度的8分钟。清洗类囊体两次, 每次 resuspending 1 到2毫升的溶解缓冲液。并用重悬与1毫升1xIB 和 requantify 智利在叶绿体隔离协议。
4. 基质提取物的回收和浓度
- 如果 SE 恢复是必要的, 把完整的叶绿体分为600µL 整除数在1.5 毫升离心管和离心机每管 1000克在摆动斗转子6分钟4°c。
注: 使用1.5 毫升离心管时, 此体积很方便, 这有助于防止残留膜的最终颗粒受到干扰。- 并用重悬在低渗裂解缓冲液中的1毫克/毫升, 在黑暗中的冰上孵化10分钟, 如步骤3.2.1。
- 离心机每管在 3200 x g在摆动斗转子8分钟4°c, 并转移到一个新的离心管与2x 粗质基质缓冲量相同体积的绿色或黄色下清。
- 洗涤类囊体与2容量溶解缓冲 (接近0.5 毫克/毫升) 和收集通过离心在 3200 g在摆动的桶式转子为8分钟在4°c。并用重悬1毫克/毫升在冰上1xIB。
- 离心机在 4.2万克的固定角度转子的粗质基质, 30 分钟4°c, 以去除残余膜。免疫印迹法外和内包络蛋白可用于验证上清的纯度。
- 收集95% 的体积从每管不干扰小黄绿色颗粒。请注意每管所取的体积。
- 制备浓缩的基质萃取物 (SE), 用4毫升 30 kDa 截留分子量选矿厂将收集的上清液浓缩五倍。
注: 以这种方式制备的 SE 相当于2.5 毫克/毫升的叶绿体中的基质。如有必要, 硒可浓缩十倍至5毫克/毫升的等量。SE 的颜色和粘性都是金色的。在实验室的传说 RT 离心机与摆动斗转子, 这需要约10分钟每毫升集中。
5. 通过 cpTat 途径运输
注: 与 cpSec1 或 cpSRP 不同, cpTat 通路不需要可溶性成分或外部增加的能量源;仅光驱动的质子动力是必要的3。因此, 只有分离的类囊体和基质蛋白是必要的化验。典型的基质是 17 kDa 的中间形式 (如图 1所示) 和 23 kDa 亚基的氧演化复杂, iOE17 和 iOE23, 但前体形式, prOE17 和 prOE23, 也可以成功地运输。前体形式具有整个二部 N 终端靶向序列, 而中间形式仅有类囊的目标序列。
- 准备 cpTat 运输组合与0.33 毫克/毫升智利类囊体, 5 毫米 ATP 从一个库存的1xIB 和8毫米 dithiothreitol (德勤) 从一只在 1xIB, 冰上准备。如果在光照下进行这种反应, ATP 是不需要严格的。
- 通过在运输组合中引入容积基质蛋白, 在一点半开始运输。如果基质蛋白不是在1xIB 制备的, 则先用2xIB 做1:1 的稀释, 然后在运输组合中用稀释后的基质的体积量一点半。
注: 基材的浓度会因制备方法而异。通常,体外制剂将允许 nanomolar micromolar 量, 而过度表达则允许 micromolar millimolar 量。检测方法也必须考虑, 因为显影和 fluorography 比免疫印迹法更敏感。 - 在室温下, 将悬浮在 80-100 µE/米2光合主动辐射 (PAR) 中照亮10分钟。如果需要运输动力学, 预平衡类囊体和反应混合到室温和照亮30分钟。
- 停止运输反应与8倍冰冷1xIB 稀释和恢复类囊体通过离心在 3200克在离心5分钟在4°c。
- 除去尚未运输的残留基质, 并用重悬120µL 中的囊体颗粒和消化外蛋白, 增加6µL 2 毫克/毫升 thermolysin 和10毫米 CaCl2 1xIB。
- 在冰上孵化40分钟的蛋白酶反应, 然后用1xIB 制备的25毫米 EDTA 来使蛋白酶淬火。
- 恢复类囊体由离心在 3200克在离心5分钟4摄氏度。洗涤恢复类囊体在 120 ul 5 毫米 EDTA 在1xIB 和转移到一个新的管。
- 离心机在 3200克在离心为5分钟在4°c。并用重悬在适当的容量 Laemmli 样品缓冲补充与10毫米 EDTA。40µL 的体积通常足以检测 SDS 页凝胶上的基底, 必要时可保存重复凝胶的样品。
- 将样品放在沸腾的水浴中10分钟, 然后用 SDS 页进行分析。显影, fluorography, 或西方印迹的非本地或表位标记的蛋白质已成功地用于检测转运蛋白。
6. 通过 cpSec1 途径运输
注: 通过 cpSec1 translocon 的运输需要基质蛋白 cpSecA112,13, 这可以通过过度表达在大肠杆菌14,15或通过集中基质恢复在类囊体隔离期间。典型的基底是氧演化复合体 (prOE33) 的 33 kDa 亚基, 如图 2所示。
- 准备 cpSec1 运输组合与0.33 毫克/毫升智利类囊体, 0.83 毫克/毫升智利当量 SE 或1.5 微克的重组 cpSecA1, 5 毫米 ATP 在冰上, 孵化为10分钟。典型的运输反应混合物这里是 72 ul, 从 60 ul 由于 SE 加法。
- 如果将使用重组 cpSecA1 代替 SE, 调整纯化 cpSecA1 与2xIB 的体积相等, 然后稀释到一个方便的浓度, 以增加运输反应 (例如, 0.75 µg/µL)。
注: 对于长期贮存, cpSecA1 是储存在冰上的控制, 冷藏室后净化作为冻结取消活动。
- 如果将使用重组 cpSecA1 代替 SE, 调整纯化 cpSecA1 与2xIB 的体积相等, 然后稀释到一个方便的浓度, 以增加运输反应 (例如, 0.75 µg/µL)。
- 通过将1:10 体积的基质蛋白引入到运输组合中来启动运输。如果基质蛋白不是在1xIB 制备的, 则准备1:1 稀释 2xIB, 并将稀释后的蛋白质的体积增加1:10 体积到运输组合中。
- 在室温下孵化反应10分钟以下 80-100 µE/米2的标准。同样, 对于动力学或某些基底, 可能需要更长的时间。
- 经过光处理, 稀释8倍与冰冷1xIB 和离心反应在 3200克在离心5分钟在4°c。
- 在步骤5.5 至5.7 中, 用 EDTA thermolysin 和淬火治疗。
- 离心机在 3200克在离心5分钟在4°c 和并用重悬颗粒在适当的容量 Laemmli 样品缓冲补充与10毫米 EDTA。在沸腾的水浴中放置10分钟, 然后再加载 SDS 页凝胶。
7. 通过 cpSRP 途径插入
注: cpSRP 介导的光收获复合蛋白 (LHCP) 的整合,如图 3所示, 需要 cpSRP54、cpSRP43 和 cpFtsY16。如 cpSec1 运输协议所述, 这些组件通过浓缩的基质萃取物提供给运输反应。
- 准备 cpSRP 运输组合与0.33 毫克/毫升智利类囊体, 0.83 毫克/毫升智利当量硒, 5 毫米 ATP 在冰和孵化10分钟。
- 通过将1:10 体积的基质蛋白引入到运输组合中来启动运输。如果基质蛋白不是在1xIB 制备的, 则准备1:1 稀释 2xIB, 并将稀释后的蛋白质的体积增加1:10 体积到运输组合中。
- 室温孵育反应为10分钟, 在 80-100 µE/米2的标准。
- 经过光处理, 稀释8倍与冰冷1xIB 和离心反应在 3200克在离心5分钟在4°c。丢弃上清液, 并用重悬120µL 1xIB 的颗粒。
- 在5.5 至5.7 节中用 thermolysin 的治疗。Thermolysin 消化是必要的, 以评估成功的膜集成。洗涤恢复类囊体在 120 ul 5 毫米 EDTA 在1xIB 和转移到一个新的管。
- 离心机在 3200 g在离心为5分钟在4°c 和并用重悬药丸再在适当的容量 2x Laemmli 缓冲补充与10毫米 EDTA。在沸腾的水浴中放置10分钟之前, 由 SDS 页分析。
注: 成熟 LHCP (mLHCP) 的整合是由蛋白酶保护降解产物 (mLHCP) 的外观来评定的, 其外形约为 1.5-2 kDa 小于 uncleaved mLHCP17。
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Representative Results
为了测量成功运输的基体的数量, 有一个或多个 "百分比输入" 车道是有用的。对于下面所示的数据, 10% 的最终运输反应没有类囊体使用。这种 "百分比输入" 也有助于可视化前体基底的大小。所述百分比表示已知的、定义的用于比较所述运输基板的基板量, 并可根据需要使用最初制备的蛋白质进行缩放。另外, 建议在 0.75 mm 聚丙烯酰胺凝胶的单一车道上加载少于4µg 的智利当量, 以避免带翘曲和涂抹。下面的所有基质都是用体外翻译工具制备和核素的。
通过 cpTat 途径运输 iOE17
图 1.iOE17through cpTat 通路的运输。Fluorograph [3H]-iOE17 转运法和 thermolysin 处理非运输基质。请单击此处查看此图的较大版本.
在 N 末端信号肽3的解裂时, 通过大小移位可以检测到大多数达基基底的成功 cpTat 传输。在没有裂解信号肽存在18、19的基底上, 需要蛋白酶处理来揭示越过细胞膜的基质, 从而使蛋白酶消化无法进入。在图 1中, iOE17 的传输结果在所介绍的基板和成熟的加工形式之间大约 2-3 kDa 的大小转移。非运输基质通过蛋白酶处理降解 (4 车道)。
通过 cpSec1 途径运输 prOE33
图 2.通过 cpSec1 途径运输 prOE33。Autoradiograph [35S]-prOE33 运输分析使用 SE, 纯化 cpSecA1, 或两者同时。请单击此处查看此图的较大版本.
通过 cpSec1 通路 (图 2) 的运输可以通过在成熟基板上的大小移位来评估, 如果基板包含裂解囊体靶向信号, 以及被运输的基板的蛋白酶保护20。
prLHCP 通过 cpSRP 途径的整合
图 3.通过 cpSRP 途径整合 prLHCP。Autoradiograph 的 [35S]-prLHCP 和消化到产品 mLHCP 后插入到囊体膜。请单击此处查看此图的较大版本.
通过 cpSRP 途径将 prLHCP 插入囊体膜中, 可以通过 thermolysin 消化来评价。大约 1.5-2 kDa 的大小转移预示着成功的膜插入, 因为膜保护 uncleaved 成熟蛋白的完全蛋白质水解15。在图 3中, 蛋白酶保护的产品 mLHCP 明显可见。
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Discussion
叶绿体和囊体分离
过度破损会导致叶绿体分离不良, 而在梯度分离后, 不良的囊体产生。最好通过确保所有物质在十五年代的混合和脉动之前被浸没, 直到完全匀质之前, 轻轻地融汇收获的组织。如有必要, 在每回合中使用较少组织的多轮混合。
冷藏所有与收获组织接触的材料可以帮助分离的叶绿体保持2小时的活动。这是重要的是保持在冰上的叶绿体在黑暗的隔离后, 以及。
在与隔离类囊体接触的缓冲器中加入镁是至关重要的。不这样做会导致 granal destacking, 并严重影响在光照21时质子动力的产生。类囊体被用于运输反应长达2小时后, 隔离时保持在冰和黑暗中。
优化运输反应
孤立的类囊体迅速解决, 并可能导致在反应之间的不平等的智利等价。因此, 在使用前彻底混合类囊体非常重要, 尤其是在设置大量样本时。
达路
由于 Tha4 (塔塔) 可以从膜22部分提取类囊体, 通过达通途径的运输效率可以减少。在这种情况下, 在运输反应之前减少囊体洗涤步骤是有帮助的。另外, 更长的光照时间可以改善在典型条件下基板传输不良的检测。
cpSec1 途径
在测定 cpSec1 通路时, 集中硒的 cpSecA1 量应支持运输, 但运输可能较弱。在分离的类囊体中有效的运输可能得益于添加某些蛋白质的纯化 cpSecA1, 但在硒中的基质伴侣也可能有助于提高运输效率15。此外, cpSecA1 蛋白的制备不应在运输使用前冻结, 因为这样可以减少运输活动。同样, 冷冻硒比刚制备的提取物更有效。在达运运输中, 运输组合中较长的潜伏期可以帮助困难的基质。
cpSRP 途径
虽然使用单个组件进行的 cpSRP 传输的重建已经完成了23, 但它很方便地提供 cpSRP43、cpSRP54 和 cpFtsY. Thermolysin 阻力是 LHCP 集成16最严格的标准, 17, 但碱性萃取也可进行17。虽然在许多运输反应中, 前体通常可以被冻结和储存在-80 摄氏度, 但体外合成制备的 prLHCP 在合成后应立即用于运输而不结冰。
一种新型基底靶向通路的表征
如果一个新的基底所采取的易位通路是未知的, 最好先用前体或中间形式的氨基酸序列来研究硅中可能的信号肽。cpTat 通路通常需要一个特定的双精氨酸共识主题的信号肽和没有 ATP 的成功运输低于3。与 cpSec1 通路不同的是, 它需要 ATP 和 cpSecA1 蛋白。在缺少这些组件的情况下传输失败表明 cpSec1 路径20。cpSRP 通路需要在 SE 中发现的信号识别粒子. 使用纯化的 cpSecA1 和 ATP 失败的运输, 但缺乏双精氨酸共识的主题在信号肽, 建议 cpSRP 途径23。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这份手稿是由化学科学、地球科学和生物科学司资助的, 408 美国能源部基础能源科学办公室通过赠款 DE-SC0017035
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 - Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
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