生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離
Summary
生理活性チラコイドの高収率分離のためにここのプロトコルおよび葉緑体ツイン アルギニン転流 (cpTat)、分泌 (cpSec1)、およびシグナル認識粒子 (cpSRP) のための蛋白質輸送アッセイを提案します。
Abstract
葉緑体は、緑色植物の多数の重要な代謝経路を運ぶための責任で細胞小器官最も特に光合成。葉緑体には、チラコイド膜システムすべての光合成色素、反応中心複合体、電子キャリアのほとんどを住宅と光依存性 ATP 合成のためあります。葉緑体タンパク質の 90% 以上は、核でエンコードされ、細胞質で翻訳、後葉緑体にインポートします。さらにタンパク質輸送やチラコイド膜は、4 つの転流経路の一つを利用しています。ここでは、3 つのエネルギー依存性 cpTat、cpSec1、および cpSRP を介した経路を介して輸送アッセイと一緒に豆 (エンドウ) からトランスポート主務チラコイドの単離のため高収率手法について述べる。これらのメソッドは、生体膜、チラコイドのタンパク質の局在、輸送エネルギーおよびタンパク質輸送のメカニズムに関する実験を有効にします。
Introduction
適切な葉緑体機能の責任タンパク質機械のほぼすべては細胞質1から移行する必要があります。葉緑体エンベロープでタンパク質は、トランスロコン (TOC) の外側の膜と内膜 (TIC)2トランスロコンを通じてインポートされます。さらに、チラコイドにターゲット膜と内腔がツイン アルギニン転 (cpTat)3、分泌 (cpSec1)4、信号認識粒子 (cpSRP)5自発挿入経路6 を通じて行われます。.生理活性の葉緑体のチラコイド膜高収率分離法はエネルギー論および転流イベント、各経路で多様なトランスポート機構を理解し、ローカライズの体内動態を測定するために必要な葉緑体の六つの異なる区画のいずれかに関心の特定のタンパク質基質です。
葉緑体膜の分離は、輸送エネルギーの測定に影響を与える要因 (塩と基質濃度 ATP/GTP と pH 条件の存在など) をより実験的制御を提供していて、速度論。この体外環境は同じ理由のための転流機構詳細の探査に適しています。さらに、葉緑体タンパク質の局在化の予言するソフトウェアは、7、8をしましたが、輸送の in vitroアッセイでは、確認のため高速な方法顕微鏡蛍光アッセイ遺伝的コード化蛍光タグ、植物形質転換および/または特定の抗体が必要です。ここでは、輸送アッセイごとエネルギー依存チラコイドの転流経路の最適化のためだけでなく、エンドウ豆 (エンドウ) から葉緑体とチラコイドの隔離のためのプロトコルを提案する.
Protocol
1. 初期の材料 400 mL の水で 3 時間のエンドウ豆の約 55 g を浸漬し、その後、プラスチック製のトレイに種をまく (35 cm × 20 cm × 6 cm) 土バーミキュ ライトの薄層で覆われています。 12/12 h/暗 (50 Με/m2s) サイクル 9 ~ 15 日の下 20 の ° C でエンドウ豆のトレイを成長します。 推奨される方法に従ってタンパク質基板を準備します。注: さまざまな 1 を含む方法を使?…
Representative Results
正常に輸送基質の量を測定するには、1 つまたは複数の「パーセント入力」車線を含めると便利です。以下に示すデータ、最終輸送反応をせずにチラコイドの 10% 使用しています。この「% 入力」前駆体基板のサイズを視覚化することができます。割合に対して輸送比較基板、基板の知られている、定義された量を表すことができます上下にタンパク質を用意して最初?…
Discussion
葉緑体とチラコイドの分離
過度の破損が発生することができます貧しい葉緑体の分離そしてこうして貧しいチラコイドをグラデーションで分離後もたらします。優しくブレンドと完全に均質になるまで 15 秒サイクルでパルスの前にすべての材料を浸漬を確保することによって収穫された組織を均質化することをお勧めします。必要に応じて、各ラウンドで以下の組織とブ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿は化学専攻、地球科学、生命科学、米国エネルギー省を介してグラント ・ デ ・ SC0017035 の基本的なエネルギー科学の 408 のオフィスで準備されました。
Materials
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
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Cite This Article
Asher, A., Ganesan, I., Klasek, L., Theg, S. M. Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays. J. Vis. Exp. (139), e58393, doi:10.3791/58393 (2018).