Yalıtım fizyolojik aktif Thylakoids ve onların kullanımı enerji bağımlı Protein taşıma deneyleri
Summary
Biz burada fizyolojik aktif thylakoids yüksek verimli izolasyon için protokoller ve protein taşıma deneyleri kloroplast ikiz arginin translocation (cpTat), salgı (cpSec1) ve sinyal tanıma parçacık (cpSRP) yolu için mevcut.
Abstract
Kloroplast vardır organelleri çok sayıda temel metabolik yollar, sorumlu yeşil bitkilerde fotosentez en önemlisi. Kloroplast içinde thylakoid membran sistemi ve fotosentetik pigment, reaksiyon merkezi kompleksleri ve elektron taşıyıcıları çoğu evler ışık bağımlı ATP sentezi için sorumludur. Kloroplast proteinlerin % 90’çekirdeğinde kodlanmış, sitozol tercüme ve daha sonra kloroplast ithal. Daha fazla protein taşıma içine veya thylakoid membran boyunca dört translocation yollar birini kullanır. Buraya, taşıma deneyleri üç enerji bağımlı cpTat, cpSec1 ve cpSRP-aracılı yolu ile birlikte bezelye (Pisum sativum), gelen taşıma-yetkili thylakoids yalıtım için yüksek verimli yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntemler thylakoid protein yerelleştirme, taşıma enerji ve protein translocation mekanizmaları biyolojik membranlar arasında ilgili deneyler etkinleştirin.
Introduction
Neredeyse tüm proteinaceous makine uygun kloroplast işlevi için sorumlu sitozol1ile translocated gerekir. Kloroplast zarflar protein yüzeylerde dış membran (TOC) translocon ve iç zar (TIC)2translocon alınır. Daha fazla thylakoid için hedefleme membran ve lümen oluşur ikiz arginin translocation (cpTat)3, salgı (cpSec1)4, sinyal tanıma parçacık (cpSRP)5ve spontan ekleme yolları6 ile . Yüksek verimli yalıtım fizyolojik aktif kloroplast ve thylakoid membran için bir yöntem enerji bilimi ve kinetik bir translocation olay, her yolu farklı taşıma mekanizmaları anlamak ve yerelleştirmek için ölçmek gerekli olan bir kloroplast altı ayrı bölmeleri hiçbirine ilgi belirli protein alt katman.
Kloroplast dan membran izolasyon taşıma enerji ölçümü etkileyen çevresel faktörler (örneğin, tuz ve substrat konsantrasyonu, ATP/GTP ve pH koşulların varlığı) üzerinde daha iyi deneysel kontrol sunar ve kinetik. Bu vitro ortamda aynı sebeplerden dolayı mekanik translocation ayrıntılarını keşif için oldukça rahat. Akıllı yazılım yerelleştirme kloroplast proteinlerin7,8geliştirdi, Ayrıca, vitro taşıma deneyleri onay için daha hızlı bir yöntem mikroskobu tabanlı floresan deneyleri üzerinde bunu sağlarken genetik olarak kodlanmış bir floresan etiketi, bitki dönüşümü ve/veya belirli antikor gerektirir. Burada, iletişim kuralları her enerji bağımlı thylakoid translocation yolları için optimize taşıma deneyleri yanı sıra, kloroplast ve thylakoid izolasyonların bezelye (Pisum sativum) üzerinden için mevcut.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kloroplast ve Thylakoid yalıtım
Aşırı kırılması neden olur zavallı kloroplast ayrılık degradedeki sonra yalıtım ve böylece zavallı thylakoid verim. Hasat doku yavaşça tüm malzeme karıştırma ve tamamen homojenize oluncaya kadar 15 s döngülerle darbe önce batık sağlayarak homojenize en iyisidir. Gerekirse, birden çok daha kısa tur her turda daha az doku ile harmanlama kullanın.
Hasat doku ile temas gelen tüm malzemeler soğutma izole kloropl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu el yazması kimyasal Bilimler Bölümü, yerbilim ve Biosciences, temel enerji Bilimler bize Enerji Bakanlığı aracılığıyla Grant DE-SC0017035, 408 Office tarafından fon ile hazırlanmıştır
Materials
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 – Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
References
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. Protein transport into chloroplasts. Annual review of plant biology. 61, (2010).
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. . Plastid Biology. , 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. . Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
