Summary
ניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותיים בזמן אמת בשילוב עם שעתוק במהופך (RT-qPCR) כבר בשימוש נרחב כדי למדוד את רמת זיהומים וירוס RNA. כאן אנו מציגים assay RT-qPCR ישיר, אשר אינה דורשת שלב טיהור RNA, שפותחה עבור כימות של כמה וירוסים RNA, כולל וירוס דנגה.
Abstract
כיום, הטכנולוגיה תגובת שרשרת (PCR) פולימראז בזמן אמת הוא כלי חיוני של זיהוי, כימות של הגנום הנגיפי במעבדות מחקר, כמו גם לאבחון מולקולרי, בגלל הרגישות שלה, ירידה לפרטים, ו מלון מקסים זה. עם זאת, ברוב המקרים, כמותיים וזמינותו PCR (qPCR) משמש בדרך כלל כדי לזהות זיהום בנגיף הסתמכה על הטיהור של חומצת גרעין נגיפיות לפני השלב ה-PCR. במחקר זה, וזמינותו qPCR (RT-qPCR) מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית שעתוק במהופך מפותחת באמצעות שילוב מאגר עיבוד עם ריאגנט RT-PCR בשלב אחד כך לעבד כל, מן הקציר של תגובת שיקוע תרבות של הנגועים בנגיף תאים עד זיהוי בזמן אמת, יכולה להתבצע ללא טיהור RNA נגיפי. פרוטוקול הוקמה מאפשר כימות של ריכוזים טווח רחב של RNA של וירוס דנגה (DENV) בתוך 90 דקות. בנוסף, יכולת ההתאמה של וזמינותו RT-qPCR ישיר על הערכת סוכן אנטי ויראליים מומחש הניסוי במבחנה באמצעות מעכב DENV שדווחה בעבר, חומצה mycophenolic (MPA). יתר על כן, ניתן לכמת וירוסים אחרים, ה-RNA, לרבות נגיף קדחת צהובה (YFV), וירוס Chikungunya (CHIKV) וירוס חצבת (תהליך), מאת RT-qPCR ישיר באותו הפרוטוקול. לכן, וזמינותו RT-qPCR ישירה שתוארו בדו ח זה שימושי עבור ניטור וירוס רנ א שכפול בצורה פשוטה ומהירה, אשר יתפתחו בהמשך לתוך פלטפורמת מבטיח תפוקה גבוהה ההקרנה מחקר, אבחון קליני.
Introduction
הסוג של Flavivirus של משפחת Flaviviridae כוללת יותר מ 70 אפוף, וירוסי RNA גדילי חיובי המועברות על ידי יתושים וקרציות. חשוב לציין, זיהום flavivirus בבני לעיתים קרובות מוביל מחלה קלינית חמורה, כגון חום, דלקת קרום המוח מדממת1. אכן, התפרצות האחרונים של הנגיף Zika (ZIKV), flavivirus, מטען התפשט בכל רחבי אמריקה, הוכח לשייכו סיבוכים נוירולוגיים, כולל microcephaly2,3. Flaviviruses, לכן, השפעה משמעותית קלינית וכלכלית על החברה המודרנית.
Flavivirus חשוב הוא וירוס דנגה (DENV), וירוס בעקיצות יתוש לתפוצה רחבה באזורים טרופיים וסובטרופיים של העולם. DENV מועברת על ידי יתושי אאדס יתושים, לרבות אדס Aedes aegypti, וכתוצאה מכך מהפכת דנגה התפרצויות4. כיום, ארגון הבריאות העולמי (WHO) מסווג את מחלת דנגי כמו לשלוש קטגוריות: קדחת דנגה ללא סימני אזהרה, קדחת דנגה עם סימני אזהרה, דנגי חמור4. למרות זיהום ראשי עם אחד ארבע אשר נגרמו מהזנים אליהם של DENV (DENV-1 ל-4) הוא לעיתים קרובות ללא תסמינים או מגבילה את עצמה, אפידמיולוגי מחקרים הראו כי זיהום משני של שונים אשר נגרמו מהזנים אליהם מגביר את הסיכון של צורות חמורות יותר של קדחת דנגה. ראוי לציין כי שיפור נוגדנים תלויי DENV דלקת הנגרמת על ידי הלא - או subneutralizing נוגדנים המיוצרים במהלך הזיהום העיקרי הוצע כמנגנון פוטנציאלי של קדחת דנגה חמור שאירע הזיהום המשני. עם זאת, אין תרופה קוטלת נגיפים מסוימים זמין עבור זיהום DENV5.
הפיתוח של סוכנים אנטי נגד DENV, השגרתי, מבחני חזקים, אשר נתונות להגדרת תפוקה גבוהה, חיוניים עבור מזהה שכפול הוירוס באופן כמותי. כמקובל, מבחני ביולוגי (למשל, פלאק assay) עבור לכימות וירוסים זיהומיות, מבחני אימונולוגי (למשל, מקושרים-אנזים immunosorbent assay [אליסה]) לזיהוי אנטיגנים ויראלי שימשו כדי לפקח על DENV שכפול במבחנה , ויוו6,7. אולם, אלה מבחני לעיתים מייגעת, דורשת מספר ימים כדי להשיג, אשר פוגעת הטיפול מספר גדול של דוגמאות. בהקשר זה, RT-qPCR הוא וזמינותו אמינה לגילוי זיהום DENV: זה ספציפית, רגיש, יחסית מהירה7. בנוסף, הטכניקה RT-qPCR יש יתרונות רבים יותר בתבנית תפוקה גבוהה. למרות זאת, ההליך טיפוסי של RT-PCR של וירוסי RNA תובע את ההתאוששות של חומצות גרעין נגיפיות מן הדוגמאות שנאספו. אמנם יכול להיות מועסק בשיטות חילוץ שונות עבור RT-qPCR, מספר השלבים נדרשים עדיין להשיג RNA נגיפי מטוהרים. בנוסף, מבחני RT-qPCR דורשות בדרך כלל יקר ספין עמודות או מסוכנים ממיסים אורגניים, ובכך תהליך הכנה יותר מסורבלת. מאז הימנעות הנזק ו/או זיהום צולב בין דגימות הוא גורם קריטי עבור כימות מוצלחת של הגנום הנגיפי, שיטה מייגעת פחות זמן רב היא המועדפת, במיוחד אם RT-qPCR לא יוחל על תבנית תפוקה גבוהה.
כאן, אנו מדווחים על הליך RT-qPCR פשוט למדידת DENV RNA ב תרבות תגובת שיקוע של תאים נגועים שאינה מערבת טיהור RNA נגיפי. פרוטוקול RT-qPCR אופטימיזציה זה מורכב משני שלבים: i) דגירה של תגובת שיקוע של תרבית תאים נגועים DENV עם עיבוד המאגר וחדר ii) צעד אחד RT-qPCR על מכשיר PCR בזמן אמת. בהתאם לכך, ניתן להבחין DENV RNA בתרבות supernatant בתוך 90 דקות (איור 1). אנו מתארים גם היישום של RT-qPCR ישיר זיהומים וירוס רנ א אחרים.
Protocol
1. הכנת תבנית ה-DNA של תקן ה-RNA
- הכן של PCR מיקס (הנפח הכולל של 50 μL, טבלה 1) באמצעות פלסמיד ה-DNA וקטור שמכיל C גינאה החדשה DENV-2 (NGC, מספר גישה: AF038403.1) 3' ללא תרגום אזור (3' UTR)8 ו תחל (T7-DENV 3 'UTR Fwd ו DENV 3' UTR Rvs) בשפופרת 0.2 מ"ל, כמו המתוארות בטבלה 2.
הערה: השלב זה אמור להתנהל תחת מכסה המנוע נקי (או חדר נקי) כדי למנוע את הזיהום של כל המוצרים הקשורים לאמפליקון. - PCR-להגביר cDNA של T7 רצף-התמזגו DENV 3' UTR ב thermocycler, שימוש בתנאים הבאים: 30 מחזורים (של 98 ° C עבור 10 s, 55 ° C 5 s, ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 5 s).
- מערבבים את תגובת ה-PCR עם 10 μL 6 x צבע ג'ל העמסה, טען אותם על agarose 1% ג'ל עם סולם הדנ א מולקולרית ועד 0.1 kilobase 10 זוגות (kbp).
- דמיינו את המוצר PCR (479 בסיסי זוגות [bp]) תחת אור UV ארוך באורך הגל באמצעות שיטת הדמיה של DNA וג'ל מערכת הדמיה. לגזור את הלהקה הדנ א באמצעות אזמל נקי.
- תמצית ה-DNA באמצעות ערכת טיהור DNA (טבלה של חומרים).
הערה: שלב טיהור זה ניתן לבצע מחוץ למכסה המנוע נקי, אבל זה חיוני כדי לשמור על סביבה נקייה במהלך התהליך כדי למנוע זיהום RNase, אשר הינה בעיה מרכזית בשלבים סטנדרטי סינתזה DENV RNA הבאים.- שוקל הפרוסה ג'ל ולהוסיף μL 100 לכידת מאגר לכל 100 מ ג של ג'ל פרוסה צינור microcentrifuge 1.5 mL.
- להמיס את הג'ל על ידי דגירה ב 60 מעלות צלזיוס למשך 5-15 דקות.
- להרכיב טור טיהור DNA עם צינור אוסף ולהעביר 600 μL של המדגם מומס העמודה טיהור.
- צנטריפוגה-16,000 x g עבור 30 s ו להשליך הזרימה דרך. אם אמצעי האחסון מדגם גדול מ 600 μL, להחיל את שאר המדגם העמודה טיהור DNA אחרי שהימרת בסיבוב הראשון, חזור על שלב זה.
- החל μL 500 לרחוץ את מאגר לעמודה טיהור DNA.
- צנטריפוגה ב 16,000 x g ב-30 s.
- מקם את העמודה לתוך צינור 1.5 מ ל microcentrifuge.
- הוסף μL 50 • תנאי המאגר, דגירה העמודה בטמפרטורת החדר במשך 1 דקה.
- צנטריפוגה-המהירות המרבית עבור 1 דקות עד elute ה-DNA.
- למדוד את הצפיפות האופטית של ה-DNA-260 ננומטר על ספקטרופוטומטרים באמצעות μL 3 מדגם eluted. השתמש באותו אמצעי אחסון של מאגר • תנאי ריקים.
הערה: תבנית ה-DNA ניתן לאחסן ב-20 ° C עד השימוש.
2. סינתזה של DENV 3' UTR RNA תקן
הערה: לשמר את ribonuclease (RNase)-סביבה נקייה ככל האפשר לבצע את השלבים הבאים. הסידור של הכימית צריכה להתבצע בתוך ברדס נקי, באמצעות נטולת נוקלאז pipets, טיפים צינורות.
- לערבב במבחנה שעתוק (IVT) התגובה (של הנפח הכולל של 20 μL) עם 100 ננוגרם של T7 RNA יזם התמזגו רצף DENV 3' UTR DNA תבנית (מתוך שלב 1.6) צינור PCR 0.2 מ"ל כפי שמתואר בטבלה3.
- דגירה התערובת ב- 37 מעלות צלזיוס ב thermocycler כבר שעתיים.
- להוסיף 1 μL של DNase התגובה IVT ולהמשיך הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- לטהר במבחנה עיבד RNA באמצעות ערכת טיהור RNA (טבלה של חומרים).
- להוסיף μL 80 ללא RNase H2O ו- 350 μL מאגר לכידת, כולל 1% β-mercaptoethanol.
- להוסיף 250 μL של 100% אתנול התגובה IVT ולערבב היטב על ידי pipetting.
- להרכיב טור טיהור RNA עם צינור אוסף ולהעביר את הדגימה RNA העמודה טיהור.
- Centrifuge זה ב- 8,000 x g עבור 15 s ו להשליך הזרימה דרך.
- החל μL 500 כביסה מאגר לעמודה טיהור RNA, centrifuge זה ב x 8000 g למשך 2 דקות.
- מקם את העמודה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
- הוסף μL 50 ללא RNase H2O ' דגירה העמודה בטמפרטורת החדר במשך 1 דקה.
- Centrifuge זה במהירות המרבית עבור 1 דקות עד elute את הרנ א.
- למדוד את הצפיפות האופטית של הרנ א-260 ננומטר על ספקטרופוטומטרים, באמצעות μL 3 מדגם eluted. השתמש באותו אמצעי אחסון של H2O ריקים.
- לקבוע את מספר עותק מסונתז DENV 3' UTR RNA. 1 ng של DENV 3' UTR RNA (462 בסיסים, איור 2) דומה לדקל 4.05 x 109 עותקים.
- לאחסן את תקן ה-RNA ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
3. עיבוד של וירוס דגימות RT-qPCR
הערה: השלבים 3.1 – 3.3 הם שיש לבצע בתוך בטיחות ביולוגית ארון. בפרט, טיפול של תגובת שיקוע תרבות המכיל וירוס מדבק בלתי שחייבת להתנהל תחת סביבת רמה 2 (ומעלה) של אבטחה.
- מיקס 199 μL של מאגר עיבוד, μL 1 של proteinase נטולת נוקלאז ק'
- באופן סדרתי לדלל את מסונתז DENV 3' UTR RNA (מתוך שלב 2.6) 1:10 להשיג 5 x 109 5 x 103 עותקים/μL של שימוש סטנדרטי RNA בתא תרבות בינונית (למשל, DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברי ואנטיביוטיקה [DMEM/10% FBS]) המכיל 40 יחידות/mL RNase מעכב.
- מיקס 5 μL של תרבות תגובת שיקוע של תאים הנגועים DENV, את DENV 3' UTR RNA סטנדרטי עם 5 μL של עיבוד פתרון מאגר/proteinase K (מתוך שלב 3.1) באמצעות רצועות PCR 8-שפופרת או צלחת PCR 96-ובכן. כפקד שאינם מתבנית (NTC), לערבב μL 5 תא תרבות בינוני (כלומר, שום וירוס כלולה) עם 5 μL של הפתרון מאגר/proteinase K עיבוד.
- לאחר צנטריפוגה קצר, דגירה הדגימות ב- thermocycler תוך שימוש בתנאים הבאים: 1 מחזור (של 25 º C למשך 10 דקות ו- 75 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות).
הערה: דגימות מעובד ניתן לשמור ב 4 ° C אם הניתוח PCR בזמן אמת נעשה באותו היום. לאחסון לטווח ארוך, הדגימות צריך להיות מאוחסן ב- 80 ° c
4. ניתוח ה-PCR בזמן אמת
הערה: מומלץ לבצע פעולות 4.1-4.4 בתוך ברדס נקי כדי למזער את הזיהום של כל המוצרים הקשורים לאמפליקון או RNase.
- להכין תערובת בסיס RT-qPCR עם ריאגנט RT-PCR צעד אחד (טבלה של חומרים) צינור microcentrifuge 1.5 mL (חינם RNase) באמצעות DENV 3' UTR ספציפיים תחל בדיקה fluorogenic (טבלאות 1). קנה המידה של הנפח של כל רכיב (טבלה 4) על פי 11% נוספים של המספר הכולל של דגימות, כולל התגובות RNA ו- NTC סטנדרטי.
- ΜL 8 aliquot של המיקס מאסטר לתוך הבאר כדי לשמש צלחת PCR 96-ובכן בזמן אמת (טבלה של חומרים).
- בקצרה centrifuge הדגימות מעובד, לרבות DENV 3' UTR RNA תקן NTC (מתוך שלב 3.4) ומוסיפים 2 μL של הדגימות מכל קידוח של צלחת PCR 96-ובכן בזמן אמת.
- חותם את הצלחת ה-PCR עם סרט דביק שטיחות ברורה.
- Centrifuge בקצרה את הצלחת ב x 200 גרם כדי להסיר בועות אוויר.
- למקם את הצלחת מכשיר PCR בזמן אמת, מחזור הלוח שימוש בתנאים הבאים: 1 מחזור של RT הבמה (25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות), מחזור 1 של השלב הפעלה פולימראז (95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות), 40 מחזורי השלב הגברה (95 ° C עבור 10 s ו- 60 ° C ל 30 s [נתונים יחיד רכישה בשלב זה]).
- לקבוע את מספר עותק RNA DENV בדגימות באמצעות תוכנת ה-PCR-הקשורים בזמן אמת.
- בחלון ההתקנה , הקצה הטוב של תגובה זו כדי להיות מנותח כדוגמה לא ידוע .
- מקצה הבאר של מדולל באופן סדרתי DENV 3' UTR RNA כמו תקן והקלד המספר הצפוי עותק של תקן ה-RNA מכל קידוח (למשל, אם 5 x 103 עותקים/μL של פתרון ה-RNA משמשים, הקלד 5,000). הקצה את הבאר כפקד שלילי עבור NTC.
- בחלון ' ניתוח ', לחץ על ניתוח וודא כי מקדם המתאם (R2) של העקומה תקן שנוצר הוא שווה או גדול מ- 0.98.
- בדרך כלל, השתמש בהגדרות ברירת המחדל של Ct (סף: אוטומטי, מחזור התחלה: אוטומטי, מחזור סיום בסיסית: אוטומטי) עבור ניתוח.
הערה: העתק במספר הדגימות לא ידוע הם מחושבים באופן אוטומטי בהתבסס על ערכי סף מחזור (Ct) של תגובות בודדות. המספר מחושב עותק של כל מדגם נחשבת RNA עותקים בכל 10 תגובה RT-qPCR μL (למשל, אם 12,345 מסומן בדוגמה לא ידוע , זה אומר 12,345 עותקים של DENV RNA נמצאים ב- התגובה).
Representative Results
כימות של DENV RNA על ידי ניתוח RT-qPCR, תקן של מספר עותק הידוע, אשר ניתן להבחין באמצעות פריימר אותו הגדר, היא תנאי הכרחי. ב פרוטוקול זה, RNA נוקלאוטיד באורך 462 המכיל את 3 'UTR רצף של המתח NGC DENV-2 היה במבחנה עיבד מ- RNA T7 יזם-התמזגו DENV-2 3' תבנית UTR DNA, אשר היה מוגבר על ידי ה-PCR, מטוהרים (איור 2 א ו 2B). כאשר לדילול 10-fold טורי בתקן DENV RNA (מתוך 5 x 109 5 x 10 עותקים2 בתגובה RT-qPCR 10 μL) היה נתון ניתוח RT-qPCR ישירה באמצעות 3' UTR ספציפיים תחל ו- fluorogenic בדיקה9, פונקציה קווית עקומת עם מקדם המתאם טוב (R2 = 0.98726) הושג (איור 2C).
בשלב הבא, זה וזמינותו RT-qPCR ישירה הוחל לכמת את DENV, תגובת שיקוע התרבות של תאים הנגועים בנגיף. DENV-2 (סינגפור ולבודד EDEN2 329510), אשר היה כבר הופץ בתאי יתושים C6/36, טיטרציה על ידי פלאק assay באמצעות תאים BHK-2111, היה מדולל באופן סדרתי (מתוך 8 x 106 ל /mL יחידות [PFU] היווצרות הפלאק 80). דוגמאות DENV היו מטופלים עם אמצעי אחסון שווה עיבוד מאגר המכיל proteinase K כדי deproteinize virions ואז לאמירה assay RT-qPCR ישיר פילוח של DENV 3' UTR RNA רצף. שוב, מתאם טוב (R2 = 0.99981) כייל זיהומיות את DENV בין ה-Ct, מספר המחזור נחשב להיות הנקודה שבה האות פלורסנט עולה עם הגידול האקספוננציאלי מעל הרקע, הושג (איור 3 א). כאשר ערכים Ct המופקים לדילול טורי של המניה DENV עם titers זיהומיות ידוע שורטטו על העקומה סטנדרטי עם במבחנה עיבד 3' UTR RNA, כולנו לחלקות המתקבל 8 x 106 80 PFU/מ ל (שווה ל- 8 x 103 8 x 10-2 PFU בתגובה RT-qPCR 10 μL) היו בטווח של אלה נתון RNA סטנדרטי (5 x 109 עד 5 x 103 העתקים בתגובה RT-qPCR 10 μL, איור 3B), המציין כי DENV דוגמאות עם מגוון רחב של מדבקות titers ניתן לנתח אותם באותו זמן, באמצעות זה RT-qPCR ישירה. בניסויים מקבילים, בדקו את ההשפעה של עיבוד המאגר או טיפול proteinase K על הגילוי של RNA נגיפי על ידי ניתוח RT-qPCR. למרות טיפול לדילול יומן רישום המדגם DENV (8 x 106 ל- 8 x 102 PFU/mL) עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) לבד לפני RT-qPCR (1:1 דילול של המדגם וירוס עם PBS) ולא של דגירה של 25 º C למשך 10 דקות ו- 75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות elicited עקומת רגרסיה (איור 3C, קו שחור), ואת הערכים Ct אומר שהושג על ידי טיפול PBS עוכבו 2.6 – 3.2 מחזורי בהשוואה ל- Ct שהושג על-ידי עיבוד טיפול מאגר/proteinase K (איור 3C, קו מנוקד). בנוסף, שאין אפשרות לזהות דילול הגבוה ביותר של הנגיף (8 x 102 PFU/mL [8 x 10-1 PFU לכל תגובה RT-qPCR 10 μL]) עם טיפול זה PBS (איור 3C). בהיעדר proteinase K במהלך הטיפול מאגר עיבוד (קואיור 3C, אפור), נוצר רגרסיה דומה; עם זאת, העיכוב הגברה (0.1 – 0.8 מחזורים) נצפתה עדיין יחסית התגובה עיבוד המכיל proteinase K (איור 3C, קו מנוקד). נתונים אלה מצביעים על כי בין התנאים נבדק, טיפול מדגם DENV עם עיבוד המאגר יחד עם proteinase K משפר את הרגישות של וזמינותו RT-qPCR.
וזמינותו RT-qPCR ישירה היה עוד יותר שקובעת את תחולתן כדי אימות סוכנים אנטי נגד DENV. Mycophenolic חומצה (MPA), מעכב nonnucleoside של inosine monophosphate דהידרוגנאז זה משמש של immunosuppressant ב ההשתלה, דווח כדי לעכב DENV במבחנה12,13. למרות המחקרים הקודמים מועסק וזמינותו של פלאק קונבנציונאלי או של assay cytometry זרימה כדי לזהות אנטיגנים ויראלית כדי להדגים את ההשפעה המעכבת של MPA על DENV זיהום12,13, בהווה ללמוד, היה ישיר RT-qPCR להחיל כדי להעריך את פעילות אנטי ויראליים של MPA. הלה תאים, אשר היה כבר נזרע על צפיפות של 5 x 104 תאים/היטב לתוך צלחת 24-ובכן יום אחד לפני זיהום, נחשפו DENV-2-MOI 1 על 1 h ותרבותית, לאחר חפיפה עם DMEM/10% FBS בנוכחות 50 – 0.016 μg/mL MPA ( או 0.1% דימתיל סולפוקסיד [דימתיל סולפוקסיד]). התרבות supernatant שנאספו 3 ימים לאחר ההדבקה, נתון וזמינותו RT-qPCR ישירה באמצעות DENV 3' UTR ספציפי תחל בדיקה פלורסנט. איור 4 מציג את העותקים DENV RNA (לפי התגובה) supernatants התרבות של תאים נגועים מטופלים עם הגדלת ריכוזים של MPA, אשר נקבעו על ידי יישום במבחנה עיבד 3' UTR RNA תקן. עם טיפול של 50 μg/mL (156 μM) MPA, נצפתה ירידה 99.87% 0.02 ± של התרבות שליטה שטופלו דימתיל סולפוקסיד (איור 4). חשוב מכך, הערך50 (50% ריכוז מעכבות) IC עבור MPA שקבע את הנתונים המוצג באיור 4 היה 0.79 μM, הדומה הערכים דיווחו בעבר12,13. תוצאה זו, לכן, מציין כי זו assay RT-qPCR ישירה היא שיטה אמין ושימושי להערכת ההשפעה המעכבת של סוכנים אנטי ויראליים על זיהום DENV.
לבסוף, נבדקו ליישומים של וזמינותו RT-qPCR ישירה וירוסים אחרים, ה-RNA. כאשר מניה של קדחת צהובה וירוס (YFV) 17D חיסון זן (Flaviviridae), אשר היה מוגבר בתאי Vero, טיטרציה על תאים BHK-21, היה נתון ישיר RT-qPCR באמצעות תחל YFV-ד 17-ספציפי, fluorogenic בדיקה14, כמו המתוארות בטבלה 1, עיקול רגיל עם טוב מתאם ישיר בין וירוס titers וערכים Ct יכול להיווצר עם דילול טורי 10-fold של המניה וירוס (3.2 x 105 ל 3.2 PFU/mL, איור 5A). כמו כן, ישיר RT-qPCR ניתוח של וירוס Chikungunya (CHIKV, Togaviridae) רוס זן במלאי, אשר היה מוגבר בתאי Vero, טיטרציה על תאים BHK-21, באמצעות תחל ספציפי CHIKV ו fluorogenic בדיקה15 (טבלה 1), נתן רגרסיה טוב בין titers זיהומית (4.4 x 10-8 4.4 x 103 PFU/mL) וערכים Ct (איור 5B). זה היה גם המקרה איתור לדילול טורי (8 x 102 עד 8 x 10-2 PFU/mL, איור 5C) של נגיף החצבת (תהליך, Paramyxoviridae) היה כבר הופץ, טיטרציה עם תאים Vero באמצעות בעבר תחל שדווחה, בדיקה fluorogenic16 (טבלה 1). נתונים אלה מדגימים את יכולת ההתאמה של וזמינותו RT-qPCR ישירה איתור כמותית של וירוסים שונים של RNA.
איור 1: זרימת העבודה של וזמינותו RT-qPCR ישיר- תגובת שיקוע התרבות של תאים הנגועים DENV מטופלת עם מאגר עיבוד המכיל proteinase K לשחרר נגיפי RNA (שלב עיבוד הדגימה). המדגם מעובד ואז מעורבב עם ריאגנט RT-PCR בשלב אחד, נתון וזמינותו PCR בזמן אמת באמצעות DENV 3' UTR ספציפיים תחל בדיקה fluorogenic. הרמות של RNA נגיפי שאותרו בדגימות המתאימים יכול להיקבע על ידי תקן מדולל באופן סדרתי באמצעות במבחנה עיבד DENV RNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: עקומת סטנדרטיים שנוצרו על-ידי DENV 3' UTR RNA. (א) RNA רגיל המכיל 3' UTR של DENV-2 NGC היה משועתקים במבחנה של T7 RNA יזם התמזגו רצף ה-PCR שבר. DENV Purified (B) 3' UTR RNA (250 ng) היה מדמיין על 1% agarose ג'ל (בנתיב הימני). הנתיב השמאלי מציג את הסמן משקל מולקולרי של RNA אלקטרופורזה. (ג) A לדילול יומן DENV 3 'UTR RNA רגיל היה שטופלו המאגר עיבוד המכיל proteinase K ונחשפו ניתוח PCR בזמן אמת באמצעות צעד אחד RT-qPCR ריאגנט DENV 3' UTR ספציפיים תחל וערכה בדיקה fluorogenic. הערכים Ct רשע (n = 3) בשנת דילולים בהתאמה שורטטו נגד הכמות המוערכת של 3' UTR RNA (5 x 109 ל RNA2 5 x 10 עותקים ב תגובה 10 μL RT-qPCR). R2 הוא מקדם המתאם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: כימות של DENV RNA במלאי וירוס על ידי ישיר RT-qPCR. (א) 2 DENV גבוהה-כייל המלאי המיוצר בתאי C6/36 היה באופן סדרתי מדולל 10-fold (8 x 106 ל- 8 x 101 PFU/mL) עם DMEM/10% FBS המכיל מעכב RNase ונחשפו וזמינותו RT-qPCR ישירה באמצעות DENV 3' UTR ספציפיים תחל /probe. (B) Ct הערכים שהתקבלו על ידי RT-qPCR של מניות מדולל-יומן הרישום DENV (מעגלים) שורטטו על עיקול רגיל של 3' UTR RNA (משולשים) עיבד במבחנה. השימוש של 8 x 106 מניות PFU/mL וזמינותו RT-qPCR ישירה מקביל 8 x 103 PFU של וירוס μL 10 RT-qPCR תגובה. (ג) לוח זה מראה את ההשפעה של עיבוד המאגר וטיפולים proteinase K את זיהוי של RNA נגיפי. DENV בדילול המניות (8 x 106 ל- 8 x 102 PFU/mL), נדגרה עם אמצעי אחסון שווה עיבוד מאגר המכיל proteinase K (עיגולים לבנים), עיבוד המאגר לבד (אפור עיגולים), או הציבורי (עיגולים שחורים) ונחשפו אז ישיר RT-qPCR assay. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: הערכת ההשפעה המעכבת של MPA מאת ישירה RT-qPCR. הלה התאים היו נגועים DENV-2-MOI של 1, בתרבית בנוכחות הגדלת ריכוזים של MPA, מעכב שדווחה בעבר DENV (או דימתיל סולפוקסיד 0.1%). שלושה ימים לאחר ההדבקה, תרבות supernatants של התאים הנגועים היו נאספים, נתון וזמינותו RT-qPCR ישירה באמצעות DENV 3' UTR ספציפיים תחל/בדיקה. המספר עותק של RNA נגיפי נקבע ע י DENV 3' UTR RNA משועתקים רגיל בתוך חוץ גופית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: היישום של RT-qPCR ישירה איתור וירוסים אחרים, רנ א. וירוס באופן סדרתי מדולל מניות של YFV (א), CHIKV (B) ו- (ג) תהליך היו נתונים וזמינותו RT-qPCR ישירה באמצעות PCR תחל, fluorogenic רגשים ספיציפית רצפי RNA נגיפי המתאימים שלהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מטרה | שם | רצף (5' - 3') | הערה |
| T7 יזם-התמזגו DENV-2 3'UTR cDNA הגברה | T7-DENV 3' UTR Fwd | T ג גה TAA טק GAC TCA CTA GG תגת א גה GGC AAA מעשה AAC ATG AAA | גופן נטוי, יזם T7; מרווח, גדולות וקטנות; מודגש, DENV-2 NGC נוקלאוטידים 10,270-10,292 |
| DENV 3' UTR Rvs | אגא ACC TGT TGA TTC AAC AGC | NGC DENV-2 נוקלאוטידים 10,723-10,703 | |
| ניתוח RT-qPCR של DENV | DENV-2 3' UTR F | AAG GAC תג AGG TTA איסור פרסום הבדיחה ACC C | הפניה 9 |
| DENV-2 3' UTR R | GGC GTT CTG TGC CTG גה TGA TG | ||
| בדיקה 2 Den-2-4 | 6FAM-AAC AGC אתא TTG ACG CTG לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה AAG ACC-טמרה | ||
| ניתוח RT-qPCR של YFV | YFV NS5 F | גה חטיבתי TGA TCA לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה ACC CTC TCT | אסמכתא 14 |
| YFV NS5 R | לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה TGT TTG GTT זיכרון מטמון של AGT AAA TGT G | ||
| בדיקה NS5 YFV | 6FAM-CTA מס רווחי הון GTC TGG AGC CCG חטיבתי סי טי-טמרה | ||
| ניתוח RT-qPCR של CHIKV | במסעדה E1 F | TCG ACG CGC CCT CTT TAA | הפניה 15 |
| במסעדה E1 R | ATC גה TGC ACC GCA CAC T | ||
| במסעדה E1 P | 6FAM-ACC AGC CTG CAC המרכז לאמנות עכשווית TTC CTC אגא C-טמרה | ||
| RT-qPCR ניתוח של תהליך | תהליך N F | TGG החתול CTG AAC TCG GTA TCA C | הפניה 16 |
| תהליך N R | TGT CCT חטיבתי תג TAT GCA TTG לפנות לסוכנות | ||
| תהליך N P | 6FAM-CCG AGG ATG לפנות לסוכנות GGC TTG TTT חטיבתי A-טמרה |
טבלה 1: פריימר Oligonucleotide ו- fluorogenic בדיקה רצפים השתמשו במחקר זה.
| רכיבים | ריכוז מניות | נפח (μL) | ריכוז סופי |
| Premix PrimeSTAR מקס | 2 x | 25 | 1 x |
| T7-DENV 3' UTR Fwd | 1 ΜM | 10 | 200 ננומטר |
| DENV 3' UTR Rvs | 1 ΜM | 10 | 200 ננומטר |
| מעט/DENV 3' UTR | 1 ng/μL | 1 | עמ' 20/μL |
| H2O נטולת נוקלאז | 4 | ||
| סה | 50 |
טבלה 2: מרכיבי ה-PCR מערבבים עבור הכנת DENV 3' UTR תבנית ה-DNA.
| רכיבים | ריכוז מניות | נפח (μL) | ריכוז סופי |
| T7 התמזגו רצף DENV 3' UTR DNA תבנית | (משתנה) | x | 100 ng לכל תגובה |
| פתרון ATP | 75 מ מ | 2 | 7.5 מ מ |
| פתרון CTP | 75 מ מ | 2 | 7.5 מ מ |
| GTP פתרון | 75 מ מ | 2 | 7.5 מ מ |
| זוג שזור פתרון | 75 מ מ | 2 | 7.5 מ מ |
| התגובה מאגר | 10 x | 2 | 1 x |
| T7 תערובת אנזימים | 2 | ||
| מעכב RNase רקומביננטי | 40 יחידות/μL | 1 | 2 יחידות/μL |
| H2O נטולת נוקלאז | 7 - x | ||
| סה | 20 |
טבלה 3: מרכיבי IVT מערבבים עבור סינתזה DENV 3' UTR RNA בתקן.
| רכיבים | ריכוז מניות | נפח (μL) | ריכוז סופי לתגובה RT-qPCR |
| iTaq אוניברסלי רגשים תערובת התגובה | 2 x | 5.00 | 1 x |
| iScript מתקדם רוורס טרנסקריפטאז | 40 x | 0.25 | 100 ng לכל תגובה |
| פריימר/בדיקה מיקס | DENV-2 3' UTR ΜM F: 3 | 1.00 | 300 ננומטר |
| DENV-2 3' UTR ΜM R: 3 | 300 ננומטר | ||
| בדיקה 2 Den-2-4: 2 μM | 200 ננומטר | ||
| H2O נטולת נוקלאז | 1.75 | ||
| סכום ביניים | 8.00 |
בטבלה 4: מרכיבי תערובת הבסיס לניתוח RT-qPCR בזמן אמת של DENV RNA. שים לב μL 2 מדגם DENV מעובד (או תקן ה-RNA) יש להוסיף לתערובת 8-μL מאסטר (סך של μL 10 לכל תגובה).
Discussion
היום, חומצת גרעין נגיפיות זיהוי על ידי מבוססי פלורסנט PCR בזמן אמת הופך להיות תקן הזהב לאבחון מולקולרי של וירוסים אנושיים פתוגניים, עקב שלה-רגישות, במהירות7. זה חשוב במיוחד עבור המאשר בנגיף בשלב מוקדם של מחלות זיהומיות חריפה כגון קדחת דנגה17. גם, בתחום של מחקר בסיסי DNEV, RT-qPCR assay הוא כלי חיוני עבור ניטור וירוס שכפול בתרבות במבחנה , אשר יוביל להבנה של הביולוגיה שכפול של DENV ושל הגילוי של מעכבי אנטי ויראליים. במחקר זה, PCR וזמינותו בזמן אמת מבוססת פלורסנט נוספת פותחה על ידי שילוב של מאגר עיבוד ריאגנט RT-PCR בשלב אחד כך DENV RNA, תגובת שיקוע התרבות של תאים נגועים הצליח ניתן לכמת מאת RT-qPCR ללא טיהור הגנום RNA נגיפי. כאשר לעומת מבחני שגרתיות לגילוי וירוס שכפול, כגון רובד assay, אליסה או קונבנציונלי RT-qPCR המעסיקים RNA טיהור6,7, פרוטוקול מפושטת של וזמינותו RT-qPCR גרמו לירידה הגדולה של הזמן, השלבים הנחוצים לכמת DENV RNA. זו גם תכונה חשובה כי יש יתרונות למזער את הזיהום ואת אובדן של חומר גנטי. עם זאת, יש לציין כי השימוש ברדס נקי חיונית ההקמה של IVT (שלב 2.1), תגובות RT-qPCR (שלבים 4.1-4.4) כדי למנוע את זיהום צולב של כל המוצרים הקשורים לאמפליקון או RNase. חשוב גם להתמודד עם התרבות supernatant, כולל וירוסים זיהומיות, בפנים אבטחה cabinet (שלב 3.3) כדי להפחית את הסיכון של זיהום מעבדה.
עוד משמעות וזמינותו RT-qPCR ישירה היא כי ניתן לנתח מגוון רחב של נגיפי RNA עותקים באותו זמן ללא דילול או ריכוז של המדגם. כאשר שימש באופן סדרתי מדולל DENV 3' UTR RNA תקן, פרוטוקול RT-qPCR ישירה המיוצר עיקול רגיל לינארית מעל שבע סדרי גודל, הגבול התחתון של כימות היה RNA 500 עותקים (איור 2). איתור DENV ב תגובת שיקוע התרבות של תאים נגועים, 8 x 103 עד 8 x 10-2 PFU וירוסים μL 10 RT-qPCR היו בתוך טווח של DENV 3' UTR RNA התקן, הגבול התחתון זיהוי (8 x 10-2 PFU) חושבה להכיל 11 , ± 7,077 400 RNA עותקים (איור 3B). ראוי לציין, כפי שדווח ב-19,18,מחקרים flavivirus מספר20, יחס גדול של עותקים RNA נגיפי וירוסים זיהומיות כייל נוגדנים (קרי, PFU) בדגימות DENV נצפתה גם במחקר זה. מופרזת זו ההנחה תהיה בעיקר בשל נוכחותם של תקינה (כלומר, שאינן זיהומיות) וירוסים או חינם RNA נגיפי שוחררו תאים נגועים ומתה. למרות היחס של RNA עותקים: PFU שהושגו במחקר זה (1.1 x 105 ל 1.3 x 105 RNA עותקים/PFU) עלתה בקנה אחד עם הנתונים המוצגים בעבר (יחסי בטווח של 1 עד 3 יומן)21,20, זה יכול להיות לייחס ההבדל בין זני וירוס, תאים או תנאים תרבות המועסקים. הסבר סביר אחר הפער הוא, מאז שום תהליך טיהור RNA היה מעורב וזמינותו RT-qPCR ישירה כפי שיתואר בהמשך, יותר DENV RNA, תגובת שיקוע תרבות יכול יזוהו על-ידי ניתוח PCR בזמן אמת ללא אובדן ויראלי חומרים גנטיים.
הפשטות של RT-qPCR ישירה מגבירה את היכולת להתמודד עם מספר רב של דוגמאות בתבניות רב טוב, כגון צלחת 96-ובכן. לכן, מאפיין זה יסייע היישום העתידי של וזמינותו RT-qPCR ישירה ממחקר תפוקה גבוהה הקרנה על הגילוי של תרופות אנטי-DENV. אכן, בדו ח זה, היישום של וזמינותו RT-qPCR ישירה ןיבל מעכב anti-DENV, MPA, נבחנה, התוצאה הראתה כי ערך50 IC של MPA מתקבל על ידי וזמינותו RT-qPCR ישירה (איור 4) היה להשוות את זה דווח במחקרים קודמים באמצעות שלט assay12,13. מדגים כי RT-qPCR ישיר assay שימושי להערכת כראוי את ההשפעה המעכבת של סוכנים אנטי ויראליים, יכול להיות מאומץ לתוך תרופה הקרנת מחקר בעתיד.
במחקר זה, נעשו ניסיונות כדי להחיל את RT-qPCR ישירה זיהוי וירוסים אחרים, ה-RNA. כמוצג באיור 5, כאשר דילולים 10-fold שלושה וירוסים אחרים של RNA (YFV, CHIKV ותהליך) לסווג סוגים שונים (Flaviviridae, Togaviridaeו- Paramyxoviridae, בהתאמה) נבחנו באמצעות בעבר תחל שדווחה, fluorogenic רגשים ספיציפית רצפי RNA נגיפי בהתאמה. טוב מתאמים בין titers זיהומיות וערכים Ct התקבלו על ידי מבחני RT-qPCR ישיר, ולא מתאמים 4-6 ליניארי סדרי גודל. הדבר מצביע על כי הפרוטוקול RT-qPCR ישירה לסגלה סוגים שונים של וירוסים RNA פשוט על ידי שינוי תחל את וירוס ספציפיים, רגשים fluorogenic.
למרות זאת, הרגישות של זיהוי מגוונות בין וירוסים שנבדקו במחקר זה (איור 5). שינוי אחד של פרוטוקול זה יכול לשפר את הגילוי של היעד וירוס רנ א צריך להיות לשימוש ערכה חדשה של רצפי פריימר/בדיקה. בנוסף, צעד מפתח עבור וזמינותו RT-qPCR ישירה מוצלח הוא חשב להיות שחרור יעיל של הגנום הנגיפי במהלך המדגם עיבוד לשלב (צעדים 3.1 – 3.4). זו תהיה חשיבות מיוחדת לאיתור וירוסים יציב כמו וירוס שאינו אפוף כמותית. למרות בתור ניסוי ראשוני, Coxsackievirus B3 (CVB3), נגיף RNA שאינו אפוף השייכים Picornaviridae, היה נתון וזמינותו RT-qPCR ישירה באמצעות תחל CVB3 הספציפי שתואר לעיל ובדיקה פלורסנט22, אמפליקון אות שאין אפשרות לזהות אפילו עם מלאי וירוס (1 x 105 PFU/mL) גבוהה-כייל חיובי. זה נחשב ניתן לייחס בעיקר על הווירוס שאינו אפוף שלמות גופנית גבוהה. עד כה, כמה מבחני ה-RT-PCR שאינם מצריכים הטיהור של חומצת גרעין פותחו כדי לזהות כמה וירוסים RNA, שמעסיקים פרוטוקולים שונים במהדורת ה-RNA שלב23,24,25, 26. לכן, השימוש טיפולים אלטרנטיביים (או נוספים), כגון דגירה של מדגם וירוס בטמפרטורה גבוהה, פוטנציאל מגביר את הרגישות של זיהוי.
לסיכום, פרוטוקול ה-RT-qPCR ישירה שפותחו במחקר זה הייתה שיטה פשוטה, מהירה אך אמין לכימות RNA נגיפי ב תגובת שיקוע התרבות של תאים נגועים. בשל הפשטות, וזמינותו RT-qPCR ישיר יכול לעבד מספר דגימות תוך זמן קצר, אשר טומן בחובו הבטחה לניתוח תפוקה גבוהה של וירוס שכפול. יתר על כן, היישום של פרוטוקול RT-qPCR ישירה וירוסים אחרים, ה-RNA הודגם גם. גישה זו, לכן, להיות כלי שימושי עבור יעילות פיקוח על זיהומים וירוס רנ א במסגרת מחקר מעבדה ואולי אף באיבחונים קליניים.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים תודה סובהאש ג'י Vasudevan (דיוק-NUS בוגר לרפואה, סינגפור) עבור ה-DENV-2 לבודד EDEN2 3295 ו- Shunro Imura (תחנת ההסגר קובה, יפן) עבור YFV זן החיסון 17D. המחברים מודים גם לחברים של המחלקה של מיקרוביולוגיה, בקרת זיהום לסיוע שלהם. עבודה זו נתמכת על ידי MEXT KAKENHI גרנט מספר JP16737900.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PrimeSTAR Max DNA Polymerase | Takara Bio. Inc | R045A | Comparable PCR reagent kit can be used. |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| 6x Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7024S | Comparable gel loading dye can be used. |
| 2-Log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200 | 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used. |
| Gel Scene Tablet | Astec | GST-33 | Comparable gel imaging system can be used. |
| illustra GFX PCR Purification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9034-70 | Comparable gel extraction kit can be used. |
| BioSpectrometer | Eppendorf | 6135000905 | Comparable spectrophotometer can be used. |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | |
| TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit. |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio. Inc | 2313A | 40 units/μL |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Comparable RNA purification kit can be used. |
| CellAmp Direct RNA Prep Kit | Takara Bio. Inc | 3733Q | |
| Proteinase K | Nacalai Tesque | 15679-06 | >600 units/mL. Comparable reagent can be used. |
| iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad | 1725141 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube. |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | StepOnePlus-01 | Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
References
- Pastorino, B., Nougairede, A., Wurtz, N., Gould, E., de Lamballerie, X. Role of host cell factors in flavivirus infection: Implications for pathogenesis and development of antiviral drugs. Antiviral Research. 87 (3), 281-294 (2010).
- Fauci, A. S., Morens, D. M. Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat. New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).
- Wen, Z., Song, H., Ming, G. L. How does Zika virus cause microcephaly? Genes and Development. 31 (9), 849-861 (2017).
- Guzman, M. G., Harris, E. Dengue. Lancet. 385 (9966), 453-465 (2015).
- Low, J. G., Ooi, E. E., Vasudevan, S. G. Current Status of Dengue Therapeutics Research and Development. Journal of Infectious Diseases. 215 (suppl_2), S96-S102 (2017).
- Sukhavachana, P., Nisalak, A., Halstead, S. B. Tissue culture techniques for the study of dengue viruses. Bulletin of the World Health Organization. 35 (1), 65-66 (1966).
- Tang, K. F., Ooi, E. E.
- Suzuki, Y., et al. Characterization of RyDEN (C19orf66) as an Interferon-Stimulated Cellular Inhibitor against Dengue Virus Replication. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005357 (2016).
- Callahan, J. D., et al. Development and evaluation of serotype- and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. Journal of Clinical Microbiology. 39 (11), 4119-4124 (2001).
- Low, J. G., et al. Early Dengue infection and outcome study (EDEN) - study design and preliminary findings. Annals of the Academy of Medicine, Singapore. 35 (11), 783-789 (2006).
- Hishiki, T., et al. Interferon-mediated ISG15 conjugation restricts dengue virus 2 replication. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 95-100 (2014).
- Diamond, M. S., Zachariah, M., Harris, E. Mycophenolic acid inhibits dengue virus infection by preventing replication of viral RNA. Virology. 304 (2), 211-221 (2002).
- Takhampunya, R., Ubol, S., Houng, H. S., Cameron, C. E., Padmanabhan, R. Inhibition of dengue virus replication by mycophenolic acid and ribavirin. Journal of General Virology. 87 (Pt 7), 1947-1952 (2006).
- Akondy, R. S., et al. Initial viral load determines the magnitude of the human CD8 T cell response to yellow fever vaccination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 3050-3055 (2015).
- Edwards, C. J., et al. Molecular diagnosis and analysis of Chikungunya virus. Journal of Clinical Virology. 39 (4), 271-275 (2007).
- Hummel, K. B., Lowe, L., Bellini, W. J., Rota, P. A. Development of quantitative gene-specific real-time RT-PCR assays for the detection of measles virus in clinical specimens. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), 166-173 (2006).
- Peeling, R. W., et al.
- Bae, H. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Colton, L., Biggerstaff, B. J., Johnson, A., Nasci, R. S. Quantification of West Nile virus in vector mosquito saliva. Journal of the American Mosquito Control Association. 21 (1), 49-53 (2005).
- Richardson, J., Molina-Cruz, A., Salazar, M. I., Black, W. 4th Quantitative analysis of dengue-2 virus RNA during the extrinsic incubation period in individual Aedes aegypti. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (1), 132-141 (2006).
- Wang, W. K., et al. Detection of dengue virus replication in peripheral blood mononuclear cells from dengue virus type 2-infected patients by a reverse transcription-real-time PCR assay. Journal of Clinical Microbiology. 40 (12), 4472-4478 (2002).
- Gnadig, N. F., et al. Coxsackievirus B3 mutator strains are attenuated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), E2294-E2303 (2012).
- Rudenko, N., Golovchenko, M., Cihlarova, V., Grubhoffer, L. Tick-borne encephalitis virus-specific RT-PCR--a rapid test for detection of the pathogen without viral RNA purification. Acta Virologica. 48 (3), 167-171 (2004).
- Pastorino, B., et al. Development of a TaqMan RT-PCR assay without RNA extraction step for the detection and quantification of African Chikungunya viruses. Journal of Virological Methods. 124 (1-2), 65-71 (2005).
- Nishimura, N., et al. Detection of noroviruses in fecal specimens by direct RT-PCR without RNA purification. Journal of Virological Methods. 163 (2), 282-286 (2010).
- Kang, K., et al. A direct real-time polymerase chain reaction assay for rapid high-throughput detection of highly pathogenic North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China without RNA purification. Journal of Animal Science and Biotechnology. 5 (1), 45 (2014).
