स्पेक्ट्रोस्कोपी और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा फाइब्रिन थक्का संरचना पर β-Amyloid-प्रेरित विषमता का विश्लेषण
Summary
यहां प्रस्तुत दो तरीकों कि व्यक्तिगत रूप से या संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है फाइब्रिन थक्का संरचना पर बीटा-amyloid के प्रभाव का विश्लेषण कर रहे हैं । शामिल एक इन विट्रो फाइब्रिन थक्का, थक्का turbidity और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तरीकों के बाद बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल है ।
Abstract
यह लेख इन विट्रो फाइब्रिन थक्के में पैदा करने के लिए तरीके प्रस्तुत करता है और स्पेक्ट्रोमेट्री और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) द्वारा थक्का गठन और संरचना पर बीटा-amyloid (Aβ) प्रोटीन के प्रभाव का विश्लेषण । Aβ, जो अल्जाइमर रोग (AD) में amyloid समुच्चय neurotoxic रूपों, फाइब्रिनोजेन के साथ बातचीत करने के लिए दिखाया गया है । इस Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत फाइब्रिन थक्का संरचनात्मक रूप से असामान्य और fibrinolysis के लिए प्रतिरोधी बनाता है. फाइब्रिन थक्के में Aβ-प्रेरित असामान्यताओं microinfarcts, सूजन, साथ ही साथ, सेरेब्रल amyloid angiopathy (CAA) के रूप में विज्ञापन विकृति के मस्तिष्कवाहिकीय पहलुओं के लिए भी योगदान कर सकते हैं । विज्ञापन विकृति में neurovascular घाटे की संभावित महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए, यौगिकों जो बाधित कर सकते है या कम Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत चिकित्सकीय मूल्य का वादा किया है विकासशील । इन विट्रो विधियों द्वारा फाइब्रिन थक्का गठन आसानी से किया जा सकता है और व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन चिकित्सकीय यौगिकों के विकास के लिए संभावित रूप से उपयोगी उपकरण हैं. यहां प्रस्तुत फाइब्रिन थक्का के इन विट्रो पीढ़ी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है, साथ ही Aβ और Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत अवरोधकों के प्रभाव का विश्लेषण । थक्का turbidity परख तेजी से है, अत्यधिक reproducible और एक साथ कई शर्तों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, Aβ-फाइब्रिनोजेन अवरोधकों की बड़ी संख्या की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है । इस स्क्रीनिंग से हिट यौगिकों और उनके फाइब्रिन थक्का वास्तुकला SEM का उपयोग करने के Aβ प्रेरित संरचनात्मक विषमताओं को सुधारने की क्षमता के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है । इन अनुकूलित प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता यहां TDI-२७६०, एक हाल ही में पहचान Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत अवरोध करनेवाला का उपयोग कर प्रदर्शन किया है ।
Introduction
अल्जाइमर रोग (AD), एक neurodegenerative बुजुर्ग रोगियों में संज्ञानात्मक गिरावट के लिए अग्रणी रोग, predominately असामान्य बीटा से उठता है-amyloid (Aβ) अभिव्यक्ति, एकत्रीकरण और ख़राब मंजूरी neurotoxicity 1 में जिसके परिणामस्वरूप, 2. Aβ समुच्चय और विज्ञापन3, सटीक रोग विकृति अंतर्निहित तंत्र के बीच अच्छी तरह से जुड़ाव के बावजूद4अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं । सबूत बढ़ाने से पता चलता है कि neurovascular घाटे प्रगति और5विज्ञापन की गंभीरता में एक भूमिका निभाते हैं, के रूप में Aβ सीधे संचार प्रणाली6के घटकों के साथ सूचना का आदान प्रदान । Aβ फाइब्रिनोजेन7,8, जो भी दोनों विज्ञापन रोगियों और माउस मॉडल9,10,11में Aβ जमा करने के लिए स्थानीयकरण के साथ एक उच्च संबंध बातचीत की है । इसके अलावा, Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत असामान्य फाइब्रिन-थक्का गठन और संरचना, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से fibrinolysis9,12के लिए प्रतिरोध लाती है । एक विज्ञापन के इलाज में चिकित्सकीय संभावना है, Aβ और फाइब्रिनोजेन13,14के बीच बातचीत बाधा द्वारा संचार घाटे को समाप्त । हम इसलिए, कई छोटे उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग और औषधीय रसायन विज्ञान13,14के दृष्टिकोण का उपयोग कर Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत बाधा यौगिकों की पहचान की । Aβ-फाइब्रिनोजेन संपर्क अवरोधकों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए, हम इन विट्रो फाइब्रिन थक्का गठन: थक्का turbidity परख और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM)14के विश्लेषण के लिए दो तरीकों अनुकूलित ।
थक्का turbidity परख यूवी दिखाई स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर फाइब्रिन थक्का गठन की निगरानी के लिए एक सीधे आगे और तेजी से विधि है । फाइब्रिन थक्का रूपों के रूप में, प्रकाश तेजी से बिखरा हुआ है और समाधान के turbidity बढ़ जाती है । इसके विपरीत जब Aβ मौजूद होता है तो फाइब्रिन का थक्का की संरचना बदल जाती है, और मिश्रण की turbidity कम हो जाती है (चित्रा १). Aβ-प्रेरित विषमताओं से थक्का turbidity को बहाल करने की क्षमता के लिए निरोधात्मक यौगिकों के प्रभाव का आकलन किया जा सकता है । जबकि turbidity परख कई शर्तों के तेजी से विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, यह थक्का आकार और संरचना पर सीमित जानकारी प्रदान करता है । SEM, जिसमें ठोस वस्तुओं की स्थलाकृति इलेक्ट्रॉन जांच से पता चला है, थक्का15,16,17,18 और के आकलन के 3 डी वास्तुकला के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है कैसे Aβ की उपस्थिति और /या निरोधात्मक यौगिकों कि संरचना9,14बदल । दोनों स्पेक्ट्रोमेट्री और SEM शास्त्रीय प्रयोगशाला तकनीक है कि विभिंन प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया गया है, उदाहरण के लिए, spectrophotometry amyloid एकत्रीकरण19,20की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है । इसी तरह, SEM भी अल्जाइमर के प्लाज्मा से गठित फाइब्रिन थक्का का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, पार्किंसंस और thromboembolic स्ट्रोक रोगियों21,22,23. यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक reproducible और तेजी से तरीके से फाइब्रिन-थक्का गठन का आकलन करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं ।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल की तैयारी के लिए निर्देश प्रदान करता है एक इन विट्रो फाइब्रिन-थक्का दोनों के साथ और बिना Aβ. यह भी फाइब्रिन थक्का गठन और संरचना पर Aβ के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए तरीकों का विवरण । Aβ-फाइब्रिनोजेन बातचीत के निषेध को मापने के लिए इन दो तरीकों की प्रभावशीलता TDI-२७६०, एक छोटे निरोधात्मक यौगिक14का उपयोग कर प्रदर्शित किया जाता है । इन तरीकों, दोनों व्यक्तिगत और एक साथ, की अनुमति के लिए तेजी से और सीधा विश्लेषण इन विट्रो फाइब्रिन थक्का गठन.
Protocol
Representative Results
Discussion
तरीकों यहां वर्णित एक reproducible और तेजी से फाइब्रिन थक्का गठन का आकलन करने का मतलब है इन विट्रो मेंप्रदान करते हैं । इसके अलावा, प्रणाली की सादगी कैसे Aβ फाइब्रिन थक्का गठन और अपेक्षाकृत सीधे आगे की संरचन?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक Masanori कावासाकी, Kazuyoshi Aso, और माइकल Foley त्रिकोणीय संस्थागत चिकित्सकीय खोज संस्थान (TDI), Aβ के संश्लेषण के लिए ंयूयॉर्क-फाइब्रिनोजेन संपर्क अवरोधकों और उनके बहुमूल्य सुझावों से धंयवाद । लेखक भी सहायक चर्चा के लिए Strickland लैब के सदस्यों को धंयवाद । यह काम NIH ग्रांट NS104386, अल्जाइमर ड्रग डिस्कवरी फाउंडेशन, और Robertson चिकित्सीय विकास निधि के लिए H.A., NIH ग्रांट NS50537, त्रि-संस्थागत चिकित्सकीय खोज संस्थान, अल्जाइमर्स ड्रग डिस्कवरी फाउंडेशन, के द्वारा समर्थित था ऩुदीन परिवार फाउंडेशन, और जॉन ए Herrmann एस॰एस॰ के लिए
Materials
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets – Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
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