Summary
להלן מוצגות שתי שיטות שבהן ניתן להשתמש בנפרד או במשולב כדי לנתח את השפעת בטא עמילואיד על מבנה קריש פיברין. כלול הוא פרוטוקול עבור יצירה של במבחנה clot פיברין, ואחריו קריש עכירות ואלקטרון סריקה שיטות.
Abstract
מאמר זה מציג שיטות ליצירת קרישי פיברין ב חוץ גופית ו ניתוח ההשפעה של חלבון (Aβ) בטא עמילואיד על היווצרות קרישי ומבנה באמצעות ספקטרומטר וסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM). Aβ, המהווה אגרגטים עמילואיד העצבים של מחלת אלצהיימר (AD), הוכח לקיים אינטראקציה עם פיברינוגן. אינטראקציה זו Aβ-פיברינוגן הופך קריש פיברין חריגות מבנית ועמיד בפני ופיברינוליזה. Aβ-induced העיוותים פיברין קרישת עשוי גם לתרום היבטים כשאבדן של פתולוגיה לספירה כגון microinfarcts, דלקת, וכן, angiopathy עמילואיד במוח (סי). בהתחשב בתפקיד הגירעונות נוירו-וסקולריים שעשוי להיות קריטי בפתולוגיה לספירה, פיתוח תרכובות אשר יכול לעכב או להפחית את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן יש ערך טיפולי מבטיח. במבחנה שיטות מאת אילו פיברין היווצרות קריש דם יכול בקלות ובאופן שיטתי להידרש הן כלים שימושיים פוטנציאל לפיתוח תרכובות טיפולית. המוצג כאן הוא פרוטוקול אופטימיזציה עבור הדור במבחנה של קריש פיברין, כמו גם ניתוח ההשפעה של מעכבי האינטראקציה Aβ ו- Aβ-פיברינוגן. וזמינותו עכירות קריש דם מהירה, לשחזור מאוד והוא יכול לשמש כדי לבדוק תנאים מרובים בו זמנית, המאפשר הקרנת הסרט מספר גדול של מעכבי Aβ-פיברינוגן. תרכובות פגע ההקרנה הזאת ניתן להעריך עוד יותר בשל יכולתן דהוא Aβ-induced מומים מבניים של האדריכלות קריש פיברין תוך שימוש ב- SEM. היעילות של פרוטוקולים ממוטבת אלה הפגינו כאן באמצעות TDI-2760, מעכב האינטראקציה Aβ-פיברינוגן שזוהו לאחרונה.
Introduction
מחלת אלצהיימר (AD), מחלת ניוון עצבי מוביל לירידה קוגניטיבית בחולים קשישים, יוכפל לאחר המרתו נובע חריג בטא עמילואיד (Aβ), צבירת וביטוי סיווג לקוי וכתוצאה מכך neurotoxicity1, 2. למרות האגודה מאופיין היטב בין Aβ אגרגטים לספירה3, המנגנונים מדויק המחלה פתולוגיה אינם מובנים היטב4. הוכחה גוברת מרמז כי הגירעונות נוירו-וסקולריים לשחק תפקיד התקדמות וחומרת של המודעה5, כפי Aβ ישירות אינטראקציה עם הרכיבים של מערכת הדם6. Aβ יש אינטראקציה גבוהה-זיקה עם פיברינוגן7,8, אשר רגישה גם על פיקדונות Aβ חולי אלצהיימר והן העכבר מודלים9,10,11. יתר על כן, האינטראקציה Aβ-פיברינוגן גורם היווצרות חריגה של clot פיברין, מבנה, כמו גם התנגדות ופיברינוליזה9,12. אפשרות טיפולית אחת בטיפול לספירה, היא שיכוך גירעונות הדם על ידי עיכוב האינטראקציה בין13,Aβ, פיברינוגן14. לכן, זיהינו מספר תרכובות קטן מעכבות את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן באמצעות הקרנה תפוקה גבוהה וכימיה מרפא גישות13,14. כדי לבדוק את היעילות של מעכבי האינטראקציה Aβ-פיברינוגן, אנחנו ממוטב שתי שיטות לניתוח של במבחנה היווצרות קרישי פיברין: ייקרש עכירות assay וסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)14.
קריש דם עכירות וזמינותו היא שיטה ישר קדימה ומהירה לניטור היווצרות קרישי פיברין באמצעות ספקטרוסקופית UV-גלוי. כמו קריש פיברין טפסים, תאורה מפוזרת יותר ויותר ומגביר עכירות של הפתרון. לעומת זאת, כאשר Aβ קיים, המבנה של קריש פיברין היא שונה, עכירות של התערובת מצטמצם (איור 1). יכול להיות שקובעת את ההשפעה של תרכובות מעכבות היכולת לשחזר עכירות קריש דם Aβ-induced הפרעות. בעוד וזמינותו עכירות מאפשר לניתוח מהיר של תנאים מרובים, הוא מספק מידע מוגבל על צורתו קריש דם. SEM, שבו לטופוגרפיה של חפצים מוצקים מתגלה על ידי אלקטרון הגישוש, מאפשר הניתוח של הארכיטקטורה תלת-ממד של17,18 16,15,קריש דם, את ההערכה של איך הנוכחות של Aβ, תרכובות מעכבות/או משנה את מבנה9,14. הן ספקטרומטר SEM הם וטכניקות מעבדה קלאסית כי שימשו למטרות שונות, לדוגמה, ספקטרופוטומטר משמש לניטור צבירת עמילואיד19,20. באופן דומה, SEM משמש גם כדי לנתח clot פיברין נוצר הפלזמה של אלצהיימר, פרקינסון, שבץ תרומבואמבוליים חולים21,22,23. הפרוטוקולים המובאים כאן הם אופטימיזציה עבור הערכת היווצרות קרישי פיברין בצורה מהירה הדירים.
פרוטוקול הבאים מספק את ההוראות להכנת במבחנה -clot פיברין עם ובלי Aβ. זה גם מפרט את שיטות כדי לנתח את השפעת Aβ על היווצרות קרישי פיברין ומבנה. היעילות של שתי השיטות למדידת עיכוב של האינטראקציה Aβ-פיברינוגן הוכח באמצעות TDI-2760, מתחם מעכבות14קטן. שיטות אלו, הן כיחידים והן יחד, מאפשרים ניתוח מהירה וישירה של במבחנה היווצרות קרישי פיברין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת Aβ42, פיברינוגן לניתוח
- להכין Aβ42 monomeric של אבקת lyophilized
- לחמם Aβ42 אבקת בטמפרטורת החדר, ספין למטה ב g x 1,500 ל 30 s.
- הוספת µL 100 של קרח hexafluoroisopropanol (HFIP) לפי 0.5 מ ג של אבקת Aβ42, תקופת דגירה של 30 דקות על קרח.
התראה: נקוט משנה זהירות בעת טיפול HFIP ולבצע כל השלבים בשכונה כימי. - להכין 20 µL aliquots ולתת שלאוויר סרטים יבש בשכונה כימי לסרטים 2-3 ח' שניתן לאחסן ב-20 ° C.
- לשקם Aβ42 monomeric, בסרט µL 10 של טרי דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) על ידי עצבנות ב sonicator אמבטיה 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף µL 190 מ מ 50 טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס) מאגר (pH 7.4), פיפטה למעלה ולמטה בעדינות.
- הסר את אגרגטים חלבון על ידי צנטריפוגה ב g x 20,817 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- דגירה של תגובת שיקוע ב 4 ° C עבור לילה ויום הבא צנטריפוגה הפתרון ב g 20,817 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי למחוק נוספות אגרגטים חלבון.
- למדוד ריכוז Aβ42 על ידי bicinchoninic חומצה (BCA) וזמינותו. טורי שתדללו טהור שור אלבומין (BSA) של 1 מ"ג/מ"ל כדי 0.0625 mg/mL כדי לייצר תקן חלבון, להוסיף 10 µL ברמה כל הבארות של צלחת רב גם כן. לדלל דגימות Aβ 1:4 ולהוסיף 10 µL הבארות דולר. לערבב BCA פתרונות A ו- B, להוסיף 200 µL כל טוב. תקופת דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולקרוא על קורא צלחת במלון-562 ננומטר. לשמור את הפתרון Aβ שנותרו על קרח, להשתמש בתכשיר עכירות assay, ב- SEM.
- להכין פתרון פיברינוגן
- למדוד 20 מ ג של אבקת פיברינוגן lyophilized לתוך צינור 15 מ"ל והשהה מחדש עם מראש ומחוממת 2 מ"ל 20 מ מ hydroxyethylpiperazine אתאן חומצה sulfonic (HEPES) מאגר (pH 7.4).
- דגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- לסנן פתרון דרך מסנן מזרק 0.2 µm ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. להוציא את הפתרון של 4 ° C ו מסנן שוב דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.1 להוציא אגרגטים פיברינוגן או קיימים פיברין.
- מודדים את ריכוז פיברינוגן מאת BCA וזמינותו. בצע את ההוראות מ שלב 1.1.8. לשמור על הפתרון פיברינוגן הנותרים 4 ° C, להשתמש בתכשיר עכירות assay, ב- SEM.
2. קריש הדם עכירות Assay
- כדי מכל קידוח ניסיוני של צלחת 96-ובכן, להוסיף µL 20 30 מיקרומטר Aβ42 פתרון משלב 1.1.8 כך הריכוז הסופי שלו היא מיקרומטר 3.0 ב- 200 µL של המאגר. להוסיף באותו אמצעי אחסון של 5% דימתיל סולפוקסיד במאגר טריס 50 מ מ (pH 7.4) למתן בארות שליטה בצלחת 96-ובכן.
הערה: הנפח המדוייק של Aβ42 בשלב זה אינו חשוב. על ההכנות ריכוז נמוך, שמשמשים אמצעי אחסון גבוהה יותר, ניתן לכוונן את עוצמת הקול של המאגר היווצרות קריש דם. עוצמת הקול הסופי צריכים להישאר 200 µL. - אם בדיקות תרכובות מעכבות, לדלל את המתחם לריכוז עבודה כמו דימתיל סולפוקסיד. הוספת תרכובת או דימתיל סולפוקסיד לבד עבור פקד לבארות עם Aβ42, לערבב היטב.
הערה: פתרון Aβ42 צריך טופס droplet דיסקרטית בתחתית הבאר, המתחם או דימתיל סולפוקסיד צריך להיות pipetted ישירות אל מרכז ה-droplet. - לדלל את הפתרון מניות של פיברינוגן מהשלב 1.2.4 במאגר היווצרות קריש דם (20 מ מ HEPES מאגר (pH 7.4), 5 מ מ CaCl2ו- 137 מ מ NaCl) ולהוסיף אותו Aβ42 בארות המכיל ושליטה של צלחת 96-ובכן. לכוון את עוצמת הקול של הפתרון פיברינוגן כך הריכוז הסופי שלו הופכת מיקרומטר 1.5 בכרך סה כ 200 µL התגובה. Pipette הפתרון לאט ולהימנע ויוצרים בועות. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לוחץ על פלטפורמה מסתובבת.
הערה: הנפח של פיברינוגן פתרון עשוי להשתנות בהתאם ריכוז המניות שלה, אך הנפח הכולל בכל אחד מהם צריך להיות µL 170 בזמן הדגירה. - להכין תרומבין פתרון על ידי המסת אבקה תרומבין מסחרית מטוהרים ddH2O לעשות פתרון מניות של 50 U/mL. לדלל לפתרון עבודה U/mL 5 במאגר HEPES 20 מ מ (pH 7.4) ישירות לפני השימוש.
- לאחר 30 דקות של דגירה, במקביל להוסיף 30 µL של תרומבין פתרון (5 U/mL) לתוך פתרונות פיברינוגן בצלחת 96-ובכן מ- 2.3 שלב באמצעות פיפטה רב-ערוצי. תוספת של תרומבין תיזום מיד היווצרות קריש דם. לכן, מוסיפים תרומבין ישירות למרכז של הפתרון פיברינוגן בזהירות כדי למנוע יצירת בועות.
הערה: הפעילות של תרומבין יכול להשתנות בין התנאים ניסיוני, כמו גם הרבה תרומבין. הריכוז הנכון הנדרש כדי לייצר robustly קרישי ייתכן שיקבע מדעית. - קרא את ספיגת של הקריש במבחנה על קורא צלחת מיד לאחר התוספת תרומבין. למדוד את ספיגת-350 nm במשך 10 דקות, כל 30-60 ס' לבצע הבדיקה כולה בטמפרטורת החדר.
הערה: תרכובות מסוימות מעכב עשוי לשנות את ספיגת פתרון-350 nm, שבו ניתן למדוד במקרה עכירות-405 ננומטר.
3. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק
- הכנה של קריש דם, קיבוע, כביסה
- המקום נקי siliconized זכוכית מעגל כיסוי שקופיות (12 מ"מ) לתוך צלחת. ובכן 12 או 24-ובכן באמצעות מלקחיים.
- להכין פיברינוגן במאגר היווצרות קריש דם. ראה פרוטוקול שלב 1.2 לפרטים.
- כדי להעריך את ההשפעה של מעכבי האינטראקציה Aβ-פיברינוגן על מבנה קריש פיברין, בצע את ההוראות עבור הדגירה כמתואר וזמינותו עכירות (שלב 2). תמיד כוללים בקרת בארות אשר מכיל פיברינוגן, בהעדר הן Aβ והן מעכבי.
- פיפטה 80 µL של תערובת פיברינוגן מהשלב 3.1.3 בשקופיות כיסוי. מורחים בעדינות את הפתרון כך היא מופצת באופן שווה על השקופית כיסוי.
- לדלל תרומבין מניות (50 U/mL) לתוך תמיסת מלח HEPES buffered 20 מ מ כדי ריכוז סופי של 2.5 U/mL ולהוסיף 20 µL ישירות אל המרכז לפתרון של פיברינוגן ללא ערבוב.
הערה: אם יש צורך, ריכוז העבודה תרומבין גבוה יותר (5 U/mL) יכול לשמש. - מכסה את הצלחת 12-ובכן עם מכסה פלסטיק, להשאירו בטמפרטורת החדר למשך 30-60 דקות.
- בזמן קרישת התגובה פועל, להכין את התייבשות ופתרונות קיבעון. להכין מאגר cacodylate נתרן (0.1 M, pH 7.4). 10% גלוטראלדהיד הפתרון מניות במאגר cacodylate נתרן (0.1 M, pH 7.4) כדי להפוך של % 2 עובד תמיסת גלוטראלדהיד מדולל. שמור כל הפתרונות על קרח. טרי מדולל גלוטראלדהיד (2%) אמור לשמש בתוך שבוע 1, כאשר מאוחסנים כראוי מקרר ב 4 º C.
- לדלל מוחלטת אתנול (100%) במים מזוקקים כפול (80%, 50% ו-20% אתנול). לשמור על אתנול פתרונות אלה מוחלטת אתנול (100%) על קרח.
זהירות: נקוט משנה זהירות בעת טיפול cacodylate נתרן גלוטראלדהיד, לבצע את הפעולות הבאות בברדס כימי. - לאחר 30 דקות, בעדינות לשטוף הקרישים עם מאגר cacodylate נתרן כקרח (0.1 M) פעמיים. להוסיף 2 מ"ל של המאגר טוב כל כך שקוע לחלוטין הקריש. מכסה את הצלחת היטב עם מכסה, תשאיר את זה למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 2 דקות, להסיר בעדינות את המאגר באמצעות פיפטה 1 מ"ל או גזע צר העברה פיפטה. חזור על פעם אחת.
- לתקן את הקרישים עם גלוטראלדהיד כקרח (2%). שמירה על הלוחית טוב קרח, להוסיף בסביבות 2-3 מ"ל של 2% גלוטראלדהיד מכל קידוח. ודא שהקרישים לחלוטין טובע. לכסות ולהשאיר את הצלחת קרח למשך 30 דקות.
- לאחר 30 דקות, בעדינות להסיר את גלוטראלדהיד מכל קידוח ולשטוף את הקרישים באמצעות מאגר cacodylate נתרן (0.1 M) כפי שתואר לעיל (2 דקות, פעמיים). לקחת את הצלחת היטב על קרח.
- טורי התייבשות של הקריש וייבוש נקודה קריטית
- מייבשים את קרישי סדרה מדורגת ממכוני אתנול קפואים מוכנים בשלב 3.1.8 (20%, 50%, 80%, 100% ו again100%) עבור 5 דקות כל אחד. הסדרה אתנול, הוסיפו 2-3 מ"ל, מוודא שהקרישים טובע. מכסה, דגירה על קרח.
- לאחר כל שלב אתנול, הסר את הפתרון אתנול באמצעות פיפטה 1 מ"ל או פיפטה חד פעמיות טפי. אל תסיר לחלוטין האתנול. ודא כי השטח קריש הדם לא חשופה לאוויר.
הערה: התייבשות מוחלטת אתנול (100%) צריכה להתבצע פעמיים. - תוך שמירה על המדגם שקועים האתנול 100% הסופי, להעביר לנקודת שיא מייבש (שיקגו). השתמש בעל מדגם רופאות או בעל מכסה עם דסקית להעברת השקופיות אל החדר רופאות. מניחים דסקית אחת לפחות בין כל שקופית.
- להוציא את השקופית כיסוי מן החדר רופאות, לעלות אותו על ספח SEM באמצעות הקלטת פחמן.
- להתיז ציפוי והדמיה
- להעביר את כל הדגימות עם ספח SEM תא ציפוי לרעוד. להוציא.
- לרעוד. להוציא מעיל בפחות מ-20 ננומטר של זהב/פלדיום או חומרים מוליכי חשמל אחרים, כגון פחמן, שימוש עם coater לרעוד. להוציא ואקום.
הערה: השתמשנו 18 ננומטר של ציפוי זהב/פלדיום. הציפוי לרעוד. להוציא בוצע עבור 45 s ומהירות ציפוי היה 4 Å / ס' לרעוד. להוציא מצופה דגימות יציבים כאשר שמרה כראוי בסביבה יבשה בטמפרטורת החדר למשך כמה שבועות. SEM ניתוח יכול להתבצע בכל עת. - לרכוש תמונות במיקרוסקופ אלקטרונים סריקה מצויד הגלאי SE2 ב-4 kV.
הערה: גודל התמונה פיקסל בתמונה זו להגדיר טווח 13 nm nm-31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במבחנה קרישת assay (עכירות), תרומבין אנזים cleaves פיברינוגן, וכתוצאה מכך להיווצרות רשת פיברין24. המשקע קריש פיברין גורמת פיזור של האור עובר דרך הפתרון, וכתוצאה מכך גדל עכירות (איור 1), דיו לפני סוף תקופת הקריאה (איור 2, ירוק). כאשר פיברינוגן, נדגרה בנוכחות Aβ42, עכירות של הפתרון פחתה, עם עקומת המתנשאים עד לגובה כמחצית המירבי של פיברינוגן לבד (איור 2 א, כחול). בפרסום האחרון, סדרה של חוסמי צבירה Aβ היו מסונתז, שקובעת את יכולתם לעכב את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן, זיהוי TDI-2760 מתחם14. השתמשנו TDI-2760 במחקר שלנו כדי לחסום את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן. כפי שדווח בעבר, בנוכחות TDI-2760, ההשפעה של Aβ היה יושבחו, כמו גם עכירות גבוהה יותר עם Aβ לבד (איור 2 א, אדום). ההשפעה של TDI-2760 לא מופיע בגלל עכירות רקע כמו המתחם לא שינתה את עכירות קריש פיברין Aβ היה נעדר (איור 2 א, סגול). ה במבחנה קרישת assay עכירות המתוארים כאן היא שיטה מהירה ופשוטה על ידי איזה clot פיברין היווצרות וגורמים זה עשוי לרכך את התהליך יכול להיות שנצפו. ניתן להשתמש GPRP, אשר ידוע להתערב עם פיברין הפילמור ויה המפריעים פיברין מונומר כפתור גומות אינטראקציות18,25 כפקד חיובי עבור וזמינותו עכירות (איור 2B). בקנה אחד עם קודמות דוחות25, עם הנוכחות של פפטיד GPRP, עכירות קריש פיברין פחתו משמעותית לעומת היווצרות קריש פיברין עם העדר שלה (איור 2B, לעומת כחול ירוק).
בעקבות באותו פרוטוקול ובאותו תנאים כמו וזמינותו עכירות שתוארו לעיל, קרישי פיברין הוכנו את הנוכחות ואת היעדר Aβ ו/או TDI-2760. . הקרישים עובדו ואז עבור מיקרוסקופ אלקטרונים על ידי קיבוע, התייבשות, נקודה קריטית ייבוש ציפוי זהב-לרעוד. להוציא (איור 1). פיברינוגן בנוכחות רק תרומבין CaCl2 הקימו רשת פיברין, עם חוטים מוארך, intercalated של פיברין, כמו גם חבילות גדולות יותר (איור 3 א). Aβ היה נוכח, הליכי המשנה של פיברין נעשה דק יותר, עם מספר הנדבקים גושים/אגרגטים המציין Aβ-induced מומים מבניים (איור 3B). בקנה אחד עם התוצאות assay עכירות, TDI-2760 חלקית שוחזר המבנה של קריש פיברין משינויים הנוצרות על-ידי Aβ, כמו גושים פחות היו להציג (איור 3 C). יחד עם וזמינותו עכירות, SEM מגלה במידה ואת האיכות של שינויים Aβ-induced היווצרות קרישי פיברין, כמו גם את האפקטיביות של תרכובת מעכבות, TDI-2760.
איור 1 : ייצוג סכמטי של ניתוח קריש פיברין עכירות assay, ב- SEM. התרשים מראה את השלבים הכרוכים בניתוח קריש פיברין ואת השפעת Aβ על עכירות קריש פיברין והטופוגרפיה מבנית. פסי קנה המידה של תמונות SEM (משמאל למטה) 2 מיקרומטר, ההגדלה הוא 10, 000 X. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : מידת ההשפעה Aβ42 על במבחנה היווצרות קרישי פיברין מאת assay עכירות. (א) פיברינוגן, נדגרה בתוך הנוכחות ואת העדר Aβ42. היווצרות קרישי היה המושרה על ידי תרומבין, וכתוצאה מכך עכירות מוגברת של הפתרון (ירוק). בנוכחות Aβ42, קריש פיברין באופן חריג נבנתה, וכתוצאה מכך ירידה עכירות (כחול). מתחם TDI-2760 או דימתיל סולפוקסיד היו מודגרות עם הפתרון פיברינוגן, עם ובלי Aβ42. TDI-2760 משוחזר Aβ42-induced ירידה של עכירות (אדום) מבלי לשנות את היווצרות קריש דם נורמלי (סגול). (B) עכירות של מעכב ופיברינוליזה הידוע, GPRP נמדדה גם בתור פקד חיובי עבור זה וזמינותו. פיברינוגן, נדגרה בתוך הנוכחות ואת היעדר מיקרומטר 1.5 GPRP, את עכירות נמדד לאחר הוספת תרומבין. בדומה Aβ42, עכירות של היווצרות קרישי פיברין פחתו משמעותית בנוכחות GPRP (כחול נגד גרין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : סריקת אלקטרונים micrographs של Aβ-induced הפרעות לאדריכלות קריש פיברין. סריקת אלקטרונים micrographs של מבנה קריש פיברין המתקבל מטוהרים פיברינוגן (א), פיברינוגן + Aβ42 (B), פיברינוגן + Aβ42 + TDI-2760 (C). היווצרות קרישי הופעל על-ידי הוספת תרומבין CaCl2 התערובת. ניתוח מבני הנתונים גילה כי קרישי דם שנוצר בנוכחות Aβ42 הם דקים גושית באופן חריג בהשוואה פיברינוגן בפני עצמו. TDI-2760, אשר ידוע לעכב האינטראקציה Aβ42-פיברינוגן, תוקן חלקית את Aβ42 המושרה חריגות מבנית של קריש פיברין. סולם בר הוא 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטות המתוארות כאן מספקים אמצעי מהיר הדירים הערכת פיברין קריש היווצרות במבחנה. יתר על כן, הפשטות של המערכת הופכת את הפרשנות של מה Aβ משפיע על היווצרות קרישי פיברין ועל מבנה יחסית ישר קדימה. בפרסום הקודם של המעבדה הזאת, זה הוצג כי מבחני אלה יכול לשמש לבדיקת תרכובות על יכולתם לעכב את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן13,14. באמצעות מבחני שני אלה, סדרה של תרכובות מסונתז נותחו על היכולת לעכב את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן. למעשה, וזמינותו עכירות קריש הדם יכול לשמש כדי לצמצם את הבריכה של תרכובות פגע לאלו אשר יש הפוטנציאל הטיפולי, כמו שלא כל תרכובות יכול לעכב את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן יכול גם לשחזר היווצרות קרישי פיברין.
ישנם כמה היבטים של עכירות וזמינותו ייתכן הדורשות פתרון בעיות או להגביל את השימוש בטכניקה זו. המגבלה העיקרית היא שלא יכולה להיות וריאציות בין הניסויים זה עלול לסבך את הפרשנות של התוצאות. חלק וריאציה זו הוא בשל הפעילות תרומבין. כדי לפתור בעיות לפעילות תרומבין, משתמשים באפשרותך לבדוק מספר ריכוזים של תרומבין לפעילות היווצרות קרישי לפני תחילת ניסויים עם תרכובות Aβ ובדיקה. תחת התנאים ניסיוני המוצג כאן, Aβ, בהיעדרו של פיברינוגן, אינה מגדילה את עכירות של הפתרון מעל רמות הרקע המציין כי נצפתה עכירות עקומות נובעים פיברין הפילמור. עם זאת, Aβ פפטיד צבירת מועדת, ריכוז גבוה יותר של Aβ פתרון כאשר שמרה במשך הרבה מאוד זמן בטמפרטורת החדר או 37 ° C (מספר שעות) יכול ליצור צבירות fibrillar והתוצאה עשויה להיות עכירות מוגברת. אם ניתוח ההשפעה פתרון Aβ אשר אוחסן במשך פרקי זמן ארוכים בטמפרטורת החדר או חמים יותר, מצב צבירה של הפתרון יכול להיקבע על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. בפרוטוקול המתוארים כאן, משמשים Aβ הטרי פתרונות פיברינוגן, אשר אמור לחסל את צבירת בעיות. עם זאת, כדי להבטיח את האיכות של ההכנות הללו הם להיות מוערך על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. בנוסף, בעת שימוש הרבה פפטיד Aβ מסחרי חדש, וצריך להעריך את מידת oligomerization והן את כמות oligomers מאת במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. כי אולי יש הרבה כדי הרבה וריאציה יחס של Aβ monomeric, אשר בהחלט משפיע על הקצב oligomerization אגרגטים preformed באיכותם פפטיד. מומלץ לבדוק את ריכוז Aβ פתרון (BCA שיטת) לפני המקננת עבור oligomerization. כדי למזער לווריאציות אלה, ניסינו באמצעות לפחות 0.1 מ"ג/מ"ל של Aβ פתרון עבור אוליגומר היווצרות התגובה.
מכיוון assay הזה הוא גם רגיש לשינויים סביבתיים קטן כגון טמפרטורה ותנועה, עכירות קריאות מכל ניסויים שונים צריך לא להיות מנותח ביחד. משמעות הדבר היא כי מספר תנאים ניתן להשוואה הוא מוגבל על ידי מספר בארות תרומבין הזה ניתן בו זמנית להוסיף עם פיפטה רב-ערוצי (כלומר., 12). צריך משתמשים גם להיות מודע שאת צמיגות או צבע מאגרי ותרכובות מבחן יכול להוביל עכירות גבוהה רקע, מסתיר את האות מ קריש פיברין, מקשה על פרשנות של הניסוי. אולם, אם כל הפקדים הכלולים בכל ניסוי, זה צריך להיות ניתן בקלות לקבוע אם רקע אות משנה את ספיגת עכירות.
וזמינותו עכירות מספק מידע אודות האם היווצרות קריש פיברין מתעכבת על-ידי Aβ, יתר על כן, אם מעכב תרכובות יכולה להקל על אפקט זה. עם זאת, זה לא לחשוף כיצד משתנה המבנה של קריש פיברין בתגובה Aβ ו/או פגע תרכובות. שאלה זו יכולה להתבצע על ידי SEM, כמו זה מאפשר עבור פריט חזותי ישיר של האדריכלות קריש דם. SEM הוא טכניקה ומבוססת ומשמש באופן שגרתי להמחשת המבנה קריש פיברינוגן מטוהרים או פלזמה. עם זאת, תהליך ההכנה המסורתי קריש לניתוח SEM יכול להיות מורכב ולגזול. יתר על כן, הבדלים קטנים פרוטוקולים בין קבוצות מחקר שונות יכול לעשות את זה מאתגר כדי לשכפל את תוצאות24. כדי לטפל בבעיות אלה פרוטוקול ממוטבת זה פותחה, שבה את השפעת Aβ לזירוז הדקיקים פיברין ובתצורות של חלבון יכול להיות שנצפו (איור 3). כפי שניתן לראות עם וזמינותו עכירות, TDI-2760 מקלה על ההשפעה של Aβ, שחזור המבנה האופייני של חבילות פיברין (איור 3).
ישנם כמה צעדים הכנת הדוגמא SEM, אשר עשויים גם לדרוש פתרון בעיות. בעת שימוש ריכוזים נמוכים מאוד של פיברינוגן (0.5 מיקרומטר או פחות), הקרישים עשוי לא להיות מחובר היטב אל השקופית זכוכית והוא יכול להיות פגום/שטף משם במהלך השלבים פיקסציה/כביסה. אם משתמש ריכוזים נמוכים של פיברינוגן, הפעם היווצרות קריש דם, בין התוספת של תרומבין קיבעון, ניתן להגדיל עד כמה שעות, כמו הדבר עשוי להגדיל את היציבות קריש דם. בנוסף, משתמשים עליך להימנע משימוש מאגר פוספט חוזק גבוה או תמיסת מלח פוספט באגירה מלאה עבור עכירות והן מבחני SEM, כמו יונים פוספט עלולים להפריע בתהליך היווצרות הקריש בתיווך סידן. אם באמצעות כל אחרים מלח גבוהה המכיל מאגר היווצרות קרישי וניתוח SEM, לאחר קיבוע, שטיפת צעדים יש גם לבצע עם ddH קר2O.
SEM ניתוח דוגמאות הלא מוליך כגון קרישי פיברין דורש ציפוי עם חלקיקים טעונים כגון, זהב, פלדיום, כסף או פחמן. עובי ציפוי הוא גורם חשוב הדמיה SEM, ככל האפשר כי ציפוי מתכת עבה מאוד מטשטשים את הטופוגרפיה אולטרה-מבנה השטח של קריש פיברין. ב פרוטוקול זה, דק ציפוי זהב/פלדיום (פחות מ-20 ננומטר) משמשות לציפוי לרעוד. להוציא. כדי להשיג עובי פחות מ-20 ננומטר, התזה שבוצע עבור 45 s עם קצב ציפוי של 4 Å / s. זה ציפוי דק (18 ננומטר) אינו מופיע כדי להסוות את תכונות פני השטח של פיברין הרכבה. עם זאת, אם מודאג לגבי מיסוך האולטרה-המבנה של קריש הדם, ציפוי פחמן יכול לשמש כחלופה זהב/פלדיום, זה ישאיר פחות "איים" של מולקולות ציפוי על החומר.
בעוד שהמוקד כאן כבר על האינטראקציה Aβ-פיברינוגן, פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות כדי לנתח את האינטראקציה של חלבונים או תרכובות אחרות עם קריש פיברין. בעקבות הוראות אלה, חוקרים אמור להיות מסוגל לשחזר במבחנה היווצרות קרישי פיברין ולבצע ניתוח עם אלה קריש דם מפושטת-עכירות assay ופרוטוקולים SEM. כפי שמוצג כאן עם החומר המדכא שפורסמו בעבר מתחם TDI-2760, שיטות אלה מספקים מידע רב ערך לגבי היווצרות קרישי פיברין שניתן להחיל נוספת מחקרים גם בתוך vitro וגם ויוו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחברים תודה מסאנורי קוואסקי Kazuyoshi אסו, מייקל פולי מ מכון דיסקברי הרפוי Tri-מוסדית (TDI), ניו-יורק של סינתזה של מעכבי האינטראקציה Aβ-פיברינוגן והצעות ערך שלהם. מחברים תודה גם חברי המעבדה סטריקלנד לדיון מועיל. עבודה זו נתמכה על ידי מענק-NIH NS104386 האלצהיימר קרן גילוי סמים, רוברטסון טיפולית הקרן עבור ה, NIH הענק NS50537, מכון דיסקברי הרפוי Tri-מוסדית, אלצהיימר סמים גילוי קרן, קרן משפחת רודין, ג'ון הרמן א עבור אס
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer's disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 24, 61-73 (2011).
- Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
- Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
- Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
- Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer's disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
- Ahn, H. J., et al. Alzheimer's disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
- Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
- Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer's disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
- Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer's disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
- Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
- Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
- Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer's disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
- Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
- Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
- Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
- Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
- Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
- Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
- Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson's disease. PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).
- Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
- Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).
