小鼠血睾丸屏障完整性的一种活体研究方法
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 通过在睾丸中注入 inulin-fitc 来评估血液睾丸屏障的完整性。这是一种有效的体内方法, 研究血液睾丸屏障完整性, 可由遗传和环境元素损害。
Abstract
精子发生是精原体在睾丸生精小管中发育为成熟精子的过程。这一过程得到了血美屏障 (Sertoli) 塞尔托利细胞连接点的支持, Sertoli 是哺乳动物体内最严密的组织屏障, 并将精原细胞上皮分离成两个隔间, 一个是基部和一个阴囊。btb 为减数分裂 i变 i变 i变的生殖细胞创造了一个独特的微环境, 并通过精子发生将减数分裂后的精子体发育为精子。在这里, 我们描述了一种可靠的检测方法来监测小鼠睾丸在体内的完整性。一个完整的 btb 阻止了 fitc 共轭菊粉从基部扩散到精子管的顶端室。与替代方法相比, 此技术适用于研究可能影响 btb 功能或完整性的基因候选物、病毒或环境毒物, 操作简单, 对手术技能的要求极少。
Introduction
哺乳动物精子发生被认为是一个高度结构化的过程, 包括精原体自我更新和分化, 通过精母细胞成为单倍体精子通过有丝分裂, 减数分裂, 和精子细胞生成, 在此期间戏剧性发生生化和形态变化。发育中的生殖细胞逐渐从精子管的底部向腔内输送。这个过程是由生殖细胞和塞尔托利细胞1,2之间的细胞接触调节的。相邻的塞尔托利细胞形成位于生精小管基部附近的 Sertoli。btb 物理上将上皮分为基底和肾上腺室。在上皮周期的第八-ix 期, 基底隔间的前瘦素精母细胞通过 btb 迁移, 进入内皮隔间 3.因此, btb 的功能是为完成减数分裂和精子发生 4,5,6提供免疫诊断的微环境.与其他仅由紧密连接点 (tj) 组成的血组织屏障 (如血脑屏障) 不同, btb 由四个不同的连接点 (tj、外质化专业、缝隙连接点和中间丝状连接点) 组成。) 塞尔托利细胞之间 1,7。
许多研究使用转基因小鼠、病毒感染和环境毒物来研究 btb 完整性的机制 7,8, 9.btb 破坏会导致精子发生和不孕不育受损。由于 Sertoli 的形成和完整性已被证实受到塞尔托利细胞8之间接触的影响, 基于分离的塞尔托利细胞原代培养的体外模型已被用于 Sertoli 研究。然而, 该模型不能准确地模拟 btb 动态在体内。此外, 没有建立这种与塞尔托利细胞共同培养的方法, 能够反映 Sertoli10、11 的所有相关结构和功能成分。
一般来说, btb 完整性检测通常基于小分子, 如 ez-link sulfo-nhs-lc-biopin 和 fitc 共轭菊粉 (inulin-fitc). 通常情况下, 生物素或 inulin-FITC 从基底隔间的扩散被 btb 结构阻断。因此, 我们能够使用这种方法来评估 btb 损伤与对照组相比的程度。虽然 btb 可能会受到某些类型的刺激的影响, 例如使用氯化镉 (cdcl2)12的治疗, 但小分子可以接触到 btb, 这些分子最终会作为指标进入肾上腺隔间。
早期体内 btb 完整性检测包括将生物素或 inulin-FITC 注入颈静脉, 这涉及手术, 具有侵入性、复杂性和耗时性。此外, 由于记者的物质通过循环在全身扩散, 在精子管中的生物素或伊努林-fitc 的局部浓度是有限的。此外, 全身接触可能会诱发免疫反应。在这里, 我们提出了一个简单而有效的体内btb 完整性检测, 使直接注射少量的 inulin-FITC 到睾丸间质。使用荧光标记法, 染色过程方便, 因为不需要二级抗体。在这里, 荧光染料进入睾丸的过程是可视化的。
Protocol
Representative Results
Discussion
精子发生在精子上皮, 是一个高度有序和动态的过程, 由生殖细胞和体细胞 (如 塞尔托利细胞)控制13。由塞尔托利细胞构建的 Sertoli 结构将精子上皮分为基底和顶端隔间。减数分裂和单倍体生殖细胞的发育发生在形成免疫屏障的顶端隔间 14.
btb 功能可能会受到有毒物质的损害, 也可能会由于与细胞连接形成有关的基因缺陷而受到…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家重点研发项目 (2016yfa0500902)、国家自然科学基金 (31471228, 31471228)、江苏杰出青年科学基金会 (bk20150047)、自然科学组织的支持。江苏省成立 (bk20140897, 14kka180005) 和江苏省创新型企业项目到 k. z。
Materials
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
Riferimenti
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