Une méthode In Vivo pour étudier l’intégrité barrière de sang-testicule souris

Summary

Nous présentons ici un protocole pour évaluer l’intégrité de barrière de sang-testicule en injectant d’inuline-FITC dans les testicules. Il s’agit d’une méthode efficace in vivo pour étudier l’intégrité de barrière de sang-testicule qui peut être compromise par des éléments génétiques et environnementaux.

Abstract

La spermatogenèse est le développement de spermatogonies en spermatozoïdes matures dans les tubules séminifères des testicules. Ce processus est soutenu par des jonctions de cellules de Sertoli à la barrière sang-testicule (BTB), qui est la barrière de tissu plus serrée dans l’organisme chez les mammifères et sépare l’épithélium séminifère en deux compartiments, une base et un adluminales. BTB crée un micro-environnement unique pour les cellules germinales de la méiose I / II et pour le développement de post-méiotique spermatides en spermatozoïdes par l’intermédiaire de la spermiogenèse. Nous décrivons ici une méthode fiable pour surveiller l’intégrité BTB de souris testicule in vivo. Un BTB intact bloque la diffusion d’inuline conjugué FITC de la basale au compartiment apical des tubes séminifères. Cette technique est adaptée pour l’étude des candidats de gène, de virus ou des substances toxiques environnementales qui peuvent affecter la fonction BTB ou intégrité, avec une procédure simple et une exigence minimale de compétences chirurgicales par rapport à d’autres méthodes.

Introduction

La spermatogénèse chez les mammifères est considéré comme un processus hautement structuré qui englobe les spermatogonies autorenouvellement et différenciation par le biais de spermatocytes en spermatozoïdes haploïdes par mitose et méiose spermiogenèse, au cours de laquelle dramatique modifications morphologiques et biochimiques se produisent. Développement des cellules germinales sont progressivement transportés de la base de la tube séminifère vers la lumière. Ce processus est réglé par contacts cellules entre les cellules germinales et les cellules de Sertoli^1,2. Les cellules de Sertoli adjacentes forment le BTB qui se trouve près de la base du tube séminifère. BTB divise physiquement l’épithélium en une basale et un compartiment adluminales. Stades VIII – IX du cycle épithélial, preleptotene/leptotène spermatocytes des compartiments basales qui traversent le BTB, entrant dans les compartiments d’adluminales³. Par conséquent, la fonction de BTB est de fournir un microenvironnement immunoprivileged pour l’achèvement de la méiose et la spermiogenèse^4,5,6. Contrairement à d’autres obstacles de la sang-tissus (p. ex., barrière hémato – encéphalique) qui sont composées uniquement de jonctions serrées (TJs), le BTB est formé par quatre jonctions différentes (TJs, spécialisations ectoplasmique, jonctions lacunaires et intermédiaire axée sur le filament desmosomes) entre Sertoli, cellules de^1,7.

De nombreuses études ont utilisé des souris génétiquement modifiées, infections virales et substances toxiques environnementales pour étudier les mécanismes de BTB intégrité^7,8,9. La perturbation de BTB induit une déficience de la spermatogenèse et hypofertilité ou d’infertilité. Depuis la formation de BTB et l’intégrité ont été confirmés d’être affectés par des contacts entre les cellules de Sertoli⁸, un modèle in vitro basé sur des cultures primaires de cellules de Sertoli isolées a été utilisé pour l’étude BTB. Toutefois, ce modèle ne peut pas imiter avec précision BTB dynamics in vivo. En outre, aucune telle co-culture de cellules germinales avec les cellules de Sertoli n’a été établie comme capables de refléter tous les éléments pertinents de structurelles et fonctionnelles du BTB^10,11.

En général, en vivo BTB intégrité tests reposent généralement sur petites molécules, telles que EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotine et inuline conjugué FITC (inuline-FITC). Normalement, la diffusion de la biotine ou inuline-FITC du compartiment basal est bloquée par la structure de BTB. Par conséquent, nous sommes en mesure d’utiliser cette méthode pour évaluer l’étendue des dégâts BTB comparée aux groupes témoins. BTB peut être compromise avec certains types de stimulations, telles que le traitement avec cadmium chlorure (CdCl₂)¹², BTB devient accessible aux petites molécules, qui finit par pénétrer dans le compartiment d’adluminales comme indicateurs.

Un début essai in vivo BTB intégrité avec consiste à injecter de la biotine ou inuline-FITC dans la veine jugulaire, qui implique une chirurgie et est envahissante, compliqué et chronophage. En outre, comme les substances journaliste diffusent à travers tout le corps par l’intermédiaire de la circulation, la concentration locale de biotine ou inuline-FITC dans les tubules séminifères est limitée. En outre, l’exposition systémique peut induire des réactions immunitaires. Nous présentons ici un simple et efficace essai in vivo BTB intégrité avec permettant une injection directe d’une petite aliquote d’inuline-FITC dans l’interstitium d’un testicule. En utilisant la fluorescence méthode d’étiquetage, le processus de coloration est commode, comme anticorps secondaires ne sont pas nécessaires. Ici, le processus de colorant fluorescent entrant dans le testicule est visualisé.

Protocol

Toutes les expériences animales effectuées ont été approuvés par le Comité de l’Université médicale de Nanjing. Les souris C57BL/6 mâles ont été détenus dans des conditions contrôlées de photopériode et étaient approvisionnées en nourriture et en eau. 1. les préparatifs Capillaires de microinjection Utilisez les capillaires microinjection avec un diamètre extérieur et intérieur dimeter longueur de 1,0 mm, 0,8 mm et 10,0 cm, respectiv…

Representative Results

Le montage expérimental pour la réalisation de l’essai d’intégrité BTB est illustré à la Figure 1. Tirez et aiguiser les capillaires de microinjection avec un extracteur capillaire et chaflanador d’une micropipette, respectivement (Figure 1 a et 1C). Le radiateur thermostatique Materiel pour microinjection sont illustrées dans la Figure 1 b et 1D. <p…

Discussion

La spermatogenèse se déroule dans l’épithélium séminifère et est un processus dynamique et hautement ordonné qui est régi par les cellules germinales et les cellules somatiques (par exemple, les cellules de Sertoli)¹³. La structure BTB, ce qui est construite par les cellules de Sertoli, divise l’épithélium séminifère en une basale et un compartiment apical. Le développement des cellules germinales méiotiques et haploïdes se produit dans le compartiment apical q…

Materials

Capillary puller	SUTTER INSTRUMENT (USA)	P-97
10x PBS	Hyclone (USA)	SH30258.01	dilution to 1× in ddH2O
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma (USA)	F6057
Adhesion microscope slides	CITOGLAS (China)	80312-3161
Cadmium chloride	Sigma (USA)	655198-5G
Confocal microscope	Zeiss (Germany)	LSM700
Dust-free paper	Kimberly-Clark (USA)	34120
Inulin-FITC	Sigma (USA)	F3272
Microinjection capillaries	Zhengtianyi (China)	BJ-40	1.0 mm × 0.8 mm  × 100 mm
Micropipette beveler	NARISHIGE (JAPAN)	EG-400
OCT	SAKURA (JAPAN)	4583
Paraformaldehyde	Sigma (USA)	P6148
Pentobarbital sodium	Merck (Germany)	P11011
Shaver	Yashen (China)
Stereo microscope	Nikon (JAPAN)	SMZ1000
Sucrose	Sangon Biotech (China)	A610498
Surgical instruments	Stronger (China)		scissors, forceps, needle holder
Syringe	KDL (China)	20163150518	0.45 mm × 0.16 mm RW LB
thermostatic heater	KELL (Nanjing, China)	KEL-2010
10x TBS, pH 7.6
0.2 M Tris	Sangon Biotech (China)	A600194
1.37 M Nacl	Sangon Biotech (China)	A610476