Een In Vivo methode om te studeren muis bloed-Testis barrière integriteit

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de bloed-testis barrière integriteit door het injecteren van inuline-FITC in teelballen. Dit is een efficiënte in-vivo -methode om te studeren bloed-testis barrière integriteit die kan worden aangetast door genetische en omgevingsfactoren elementen.

Abstract

Spermatogenese is de ontwikkeling van de testis tot volwassen spermacellen in de seminiferous tubuli van de testis. Dit proces wordt ondersteund door de Sertoli cell kruispunten op de bloed-testis barrière (BTB), die is de strakste barrière van het weefsel in het lichaam van zoogdieren en beveiligingsmethode de seminiferous epitheel in twee compartimenten, een basale en een adluminal. De BTB creëert een unieke communicatie voor kiemcellen in meiose I / II en voor de ontwikkeling van postmeiotic spermatids in spermacellen via spermiogenesis. Hier beschrijven we een betrouwbare test om te controleren van de integriteit van het BTB van muis testis in vivo. Een intact BTB blokkeert de verspreiding van FITC-geconjugeerd inuline uit de basale tot het apicale compartiment van de seminiferous buisjes. Deze techniek is geschikt voor de studie van gene kandidaten, virussen of milieu toxische stoffen die BTB functionaliteit of integriteit, met een eenvoudige procedure en een minimale vereiste voor chirurgische vaardigheden in vergelijking met alternatieve methoden kunnen beïnvloeden.

Introduction

Zoogdieren spermatogenese wordt beschouwd als een zeer gestructureerde proces dat spermatogonia zelf-vernieuwing en differentiatie via spermatocyten in de haploïde spermacellen via mitose, meiose, en spermiogenesis, gedurende welke dramatische omvat biochemische en morfologische veranderingen optreden. Ontwikkelende geslachtscellen worden geleidelijk vervoerd vanaf de basis van de seminiferous zaadvormende richting de lumen. Dit proces wordt gereguleerd door cel contacten tussen kiemcellen en Sertoli cellen^1,2. Aangrenzende Sertoli cellen vormen de BTB die zich in de buurt van de basis van de seminiferous zaadvormende bevindt. De BTB verdeelt fysiek het epithelium in een basale en een adluminal-compartiment. Tijdens fase VIII – IX van de epitheliale cyclus, migreren preleptotene/leptotene spermatocyten van de basale compartimenten over het BTB, de adluminal compartimenten³invoeren. Daarom wil de functie van het BTB bieden een immunoprivileged communicatie voor de voltooiing van de meiose en spermiogenesis^4,5,6. In tegenstelling tot andere bloed-weefsel-barrières die (b.v., bloed – hersenbarrière) en dat alleen uit strakke kruispunten (TJs bestaat), wordt de BTB gevormd door vier verschillende kruispunten (TJs, ectoplasmic specialisaties kloof kruispunten en intermediair gloeidraad gebaseerde desmosomes) tussen Sertoli cellen^1,7.

Vele studies hebben gebruikt genetisch gemodificeerde muizen, virusinfecties en toxische stoffen in het milieu te onderzoeken van de mechanismen van BTB integriteit^7,8,9. De verstoring van de BTB induceert verminderde spermatogenese en subfertility of onvruchtbaarheid. Aangezien de BTB vorming en integriteit zijn bevestigd te worden beïnvloed door contacten tussen Sertoli cellen⁸, een in vitro model gebaseerd op de primaire cultuur van geïsoleerde Sertoli cellen is gebruikt voor BTB studie. Echter dit model kan niet nauwkeurig na te bootsen BTB dynamiek in vivo. Bovendien is geen dergelijke co cultuur van kiemcellen met Sertoli cellen opgezet als staat als gevolg van alle relevante structurele en functionele onderdelen van het BTB^10,11.

In het algemeen, zijn in vivo de tests van de integriteit van het BTB meestal gebaseerd op kleine molecules, zoals EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotine en FITC-geconjugeerd inuline (inuline-FITC). Normaal gesproken, wordt de verspreiding van biotine of inuline-FITC van de basale compartiment geblokkeerd door BTB structuur. Daarom kunnen wij deze methode gebruiken om te beoordelen in welke mate van BTB schade in vergelijking met controlegroepen. Terwijl BTB kan worden aangetast met bepaalde soorten stimuli, zoals behandeling met cadmium chloride (CdCl₂)¹², wordt BTB toegankelijk voor kleine molecules, die uiteindelijk het compartiment van de adluminal als indicatoren invoeren.

Een vroege in vivo BTB integriteit bepaling houdt injecteren van biotine of inuline-FITC in de halsslagader, die houdt van chirurgie, en invasieve, ingewikkeld en tijdrovend. Bovendien, als de verslaggever stoffen door het hele lichaam via het verkeer verspreiden, de plaatselijke concentratie van biotine of inuline-FITC in de seminiferous buisjes is beperkt. Systemische blootstelling kan bovendien immuunreacties veroorzaken. Hier presenteren we een eenvoudige en effectieve in-vivo BTB integriteit assay directe injectie van een kleine hoeveelheid van de inuline-FITC in het interstitium van een testis inschakelen. Met behulp van de TL labeling methode, is de kleuring proces handig, als secundaire antilichamen niet vereist zijn. Hier is het proces van fluorescente kleurstof invoeren van de testis gevisualiseerd.

Protocol

Alle uitgevoerde dierproeven zijn goedgekeurd door het Comité van de Nanjing Medizinische Universität. Mannelijke C57BL/6 muizen werden gehouden onder omstandigheden van de gecontroleerde fotoperiode en werden bevoorraad met voedsel en water. 1. voorbereiding Microinjection haarvaten Gebruik van microinjection haarvaten met een buitendiameter, innerlijke dimeter en lengte van 1,0 mm, 0,8 mm en 10,0 cm, respectievelijk. Trek glas haarvaten met …

Representative Results

De experimentele opstelling voor het uitvoeren van de bepaling van BTB integriteit is afgebeeld in Figuur 1. Trek en verscherpen microinjection haarvaten met een capillaire trekker en micropipet beveler, respectievelijk (figuur 1A en 1 C). De thermostaat van de kachel en de apparatuur van microinjection worden geïllustreerd in figuur 1B en 1 D. <p class="jove_co…

Discussion

Spermatogenese vindt plaats in de seminiferous epitheel en is een zeer geordende en dynamisch proces, dat wordt beheerst door kiemcellen en somatische cellen (bijvoorbeeld, Sertoli cellen)¹³. De BTB-structuur, die is gebouwd door de Sertoli-cellen, verdeelt de seminiferous epitheel in een basale en een apicaal compartiment. De ontwikkeling van Meiotische en haploïde geslachtscellen treedt op in de apicale compartiment dat een immunologische barrière^{14 vormt</s…}

Materials

Capillary puller	SUTTER INSTRUMENT (USA)	P-97
10x PBS	Hyclone (USA)	SH30258.01	dilution to 1× in ddH2O
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma (USA)	F6057
Adhesion microscope slides	CITOGLAS (China)	80312-3161
Cadmium chloride	Sigma (USA)	655198-5G
Confocal microscope	Zeiss (Germany)	LSM700
Dust-free paper	Kimberly-Clark (USA)	34120
Inulin-FITC	Sigma (USA)	F3272
Microinjection capillaries	Zhengtianyi (China)	BJ-40	1.0 mm × 0.8 mm  × 100 mm
Micropipette beveler	NARISHIGE (JAPAN)	EG-400
OCT	SAKURA (JAPAN)	4583
Paraformaldehyde	Sigma (USA)	P6148
Pentobarbital sodium	Merck (Germany)	P11011
Shaver	Yashen (China)
Stereo microscope	Nikon (JAPAN)	SMZ1000
Sucrose	Sangon Biotech (China)	A610498
Surgical instruments	Stronger (China)		scissors, forceps, needle holder
Syringe	KDL (China)	20163150518	0.45 mm × 0.16 mm RW LB
thermostatic heater	KELL (Nanjing, China)	KEL-2010
10x TBS, pH 7.6
0.2 M Tris	Sangon Biotech (China)	A600194
1.37 M Nacl	Sangon Biotech (China)	A610476