Vivo में एक विधि माउस रक्त-वृषण बाधा अखंडता का अध्ययन करने के लिए
Summary
यहां, हम परीक्षण में inulin-FITC इंजेक्शन द्वारा रक्त वृषण बाधा अखंडता का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस vivo विधि में कुशल रक्त-वृषण बाधा अखंडता है कि आनुवंशिक और पर्यावरणीय तत्वों से समझौता किया जा सकता है अध्ययन करने के लिए है ।
Abstract
शुक्राणुजनन नलिकाओं के सेमिनीफेरस वृषण में परिपक्व शुक्राणु में spermatogonia का विकास होता है. इस प्रक्रिया Sertoli सेल जंक्शनों द्वारा रक्त-वृषण बैरियर (BTB) है, जो स्तनधारी शरीर में सबसे तंग ऊतक बाधा है और दो डिब्बों, एक बेसल और एक सेमिनीफेरस में adluminal उपकला पृथक्करण द्वारा समर्थित है । BTB अर्धसूत्रीविभाजन में रोगाणु कोशिकाओं के लिए एक अद्वितीय microenvironment बनाता है I/II और spermatids के माध्यम से शुक्राणु में postmeiotic spermiogenesis के विकास के लिए । यहां, हम एक विश्वसनीय परख का वर्णन vivo मेंमाउस वृषण के BTB अखंडता पर नजर रखने के लिए । एक बरकरार BTB ब्लॉक FITC के प्रसार-संयुग्मित inulin बेसल से शिखर सेमिनीफेरस के नलिकाओं डिब्बे के लिए । इस तकनीक जीन उंमीदवारों, वायरस, या पर्यावरणीय विषालु है कि BTB समारोह या अखंडता को प्रभावित कर सकते है अध्ययन के लिए उपयुक्त है, एक आसान प्रक्रिया के साथ और वैकल्पिक तरीकों की तुलना में शल्य चिकित्सा कौशल की एक ंयूनतम आवश्यकता ।
Introduction
स्तनधारी शुक्राणुजनन एक उच्च संरचित प्रक्रिया है कि spermatocytes के माध्यम से अगुणित शुक्राणु में बँटवारा, अर्धसूत्रीविभाजन, और spermiogenesis, जो दौरान नाटकीय के माध्यम से स्व-नवीकरण और भेदभाव spermatogonial शामिल माना जाता है जैव रासायनिक और रूपात्मक परिवर्तन होते हैं । विकासशील रोगाणु कोशिकाओं को उत्तरोत्तर लुमेन की ओर सेमिनीफेरस tubule के आधार से पहुंचाया जाता है । यह प्रक्रिया रोगाणु कोशिकाओं और Sertoli कोशिकाओं1,2के बीच सेल सेल संपर्कों द्वारा विनियमित है । सन्निकट Sertoli कक्ष BTB सेमिनीफेरस tubule के आधार के पास स्थित है जो प्रपत्र । BTB शारीरिक रूप से एक बेसल और एक adluminal डिब्बे में उपकला विभाजित । चरणों के दौरान आठवीं-ग्यारहवीं उपकला चक्र की, preleptotene/leptotene spermatocytes बेसल डिब्बों से BTB भर में विस्थापित, adluminal डिब्बों में प्रवेश3. इसलिए, BTB के समारोह अर्धसूत्रीविभाजन और spermiogenesis4,5,6के पूरा होने के लिए एक immunoprivileged microenvironment प्रदान करना है । अन्य रक्त ऊतक अवरोधों (जैसे, रक्त मस्तिष्क बाधा) है कि केवल तंग जंक्शनों (TJs) से बना रहे हैं के विपरीत, BTB चार विभिन्न जंक्शनों (TJs, ectoplasmic विशेषज्ञता, अंतर जंक्शनों, और मध्यवर्ती रेशा आधारित द्वारा बनाई गई है desmosomes) Sertoli कोशिकाओं के बीच1,7.
कई अध्ययनों का इस्तेमाल किया है आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों, वायरस के संक्रमण, और पर्यावरण विषालु BTB अखंडता7,8,9के तंत्र की जांच करने के लिए । BTB व्यवधान बिगड़ा शुक्राणुजनन और उपप्रजनन या बांझपन लाती है । BTB गठन और अखंडता Sertoli8कोशिकाओं के बीच संपर्कों से प्रभावित होने की पुष्टि की गई है के बाद से, एक इन विट्रो मॉडल अलग Sertoli कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति पर आधारित BTB अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, इस मॉडल सही BTB गतिशीलता में vivoकी नकल नहीं कर सकता । इसके अलावा, कोई ऐसी सह Sertoli कोशिकाओं के साथ रोगाणु कोशिकाओं की संस्कृति के रूप में स्थापित किया गया है BTB10,11के सभी प्रासंगिक संरचनात्मक और कार्यात्मक घटकों को प्रतिबिंबित करने में सक्षम ।
सामांय में, vivo BTB अखंडता परख में आमतौर पर ऐसे ईज़ी लिंक Sulfo-एन एच एस-नियंत्रण-बायोटिन और FITC-संयुग्मित inulin (inulin-FITC) के रूप में छोटे अणुओं, पर आधारित हैं । आम तौर पर, बेसल डिब्बे से बायोटिन या inulin-FITC का प्रसार BTB संरचना द्वारा अवरुद्ध है । इसलिए, हम नियंत्रण समूहों के साथ तुलना में BTB क्षति की सीमा का आकलन करने के लिए इस विधि का उपयोग करने में सक्षम हैं । जबकि BTB कैडमियम क्लोराइड (CdCl2)12के साथ उपचार के रूप में कुछ प्रकार की उत्तेजनाओं के साथ समझौता किया जा सकता है, BTB छोटे अणुओं, जो अंततः संकेतक के रूप में adluminal डिब्बे में प्रवेश करने के लिए सुलभ हो जाता है ।
vivo BTB अखंडता परख में एक जल्दी jugular नस में बायोटिन या inulin-FITC इंजेक्शन शामिल है, जो शल्य चिकित्सा शामिल है, और आक्रामक, जटिल है, और समय लेने वाली । इसके अलावा, रिपोर्टर पदार्थ परिसंचरण के माध्यम से पूरे शरीर के माध्यम से फैलाना, सेमिनीफेरस नलिकाओं में बायोटिन या inulin-FITC की स्थानीय एकाग्रता सीमित है । इसके अलावा, प्रणालीगत जोखिम प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकते हैं । यहां, हम एक सरल और vivo BTB अखंडता परख एक interstitium के वृषण में inulin-FITC के एक छोटे aliquot के प्रत्यक्ष इंजेक्शन को सक्षम करने में प्रभावी वर्तमान । फ्लोरोसेंट लेबलिंग विधि का प्रयोग, धुंधला प्रक्रिया सुविधाजनक है, के रूप में माध्यमिक एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं कर रहे हैं । यहां, फ्लोरोसेंट डाई वृषण में प्रवेश करने की प्रक्रिया visualized है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
शुक्राणुजनन सेमिनीफेरस उपकला में जगह लेता है और एक उच्च आदेश दिया और गतिशील प्रक्रिया है कि रोगाणु कोशिकाओं और दैहिक कोशिकाओं द्वारा नियंत्रित किया जाताहै (जैसे , Sertoli कोशिकाओं)13. BTB संरच?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास चीन के कार्यक्रम (2016YFA0500902), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३१४७१२२८, ३१७७१६५३), प्रतिष्ठित युवा विद्वानों (BK20150047), प्राकृतिक विज्ञान के लिए Jiangsu विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया Jiangsu प्रांत की नींव (BK20140897, 14KJA180005) और Jiangsu प्रांत के अभिनव और उद्यमी कार्यक्रम K.Z. को
Materials
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
Riferimenti
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
- Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).
- Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).
- O’Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?. Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
- Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).
- Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).
- Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).
- Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).
- Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).
- Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the ‘blood-testis barrier’ after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).
- Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
- Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).
- Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?. Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).
- Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).
- Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).
- Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).
- Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).
