En i Vivo -metode for å studere musen blod-testikkel barriere integritet
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å vurdere blod-testikkel barriere integritet ved å injisere inulin-FITC inn testiklene. Dette er en effektiv i vivo -metode for å studere blod-testikkel barriere integritet som kan kompromitteres av genetiske og miljømessige elementer.
Abstract
Spermatogenesis er utvikling av spermatogonia i eldre spermatozoa i seminiferous tubules av testikkel. Denne prosessen er støttet av Sertoli celle veikryss på blod-testikkel barrieren (BTB), som er strammeste vev barrieren i pattedyr kroppen og segregerer seminiferous epitel i to avdelinger, en basal og en adluminal. BTB skaper en unik microenvironment for bakterie celler i meiose jeg / II og for utvikling av postmeiotic spermatids i spermatozoa via spermiogenesis. Her beskriver vi en pålitelig analysen for å overvåke BTB integriteten til mus testikkel i vivo. En intakt BTB blokkerer spredningen av FITC-konjugerte inulin fra de basale apikale rommet av seminiferous tubules. Denne teknikken er egnet for å studere genet kandidater, virus eller miljømessige giftstoffer som kan påvirke BTB funksjonen eller integritet, med en enkel prosedyre og et minimalt krav av kirurgiske ferdigheter sammenlignet med alternative metoder.
Introduction
Pattedyr spermatogenesis regnes som en svært strukturerte prosessen som omfatter spermatogonial selvtillit fornyelse og differensiering gjennom spermatocytes i haploid spermatozoa via mitose, meiose og spermiogenesis, som dramatisk biokjemiske og morfologiske endringer skje. Utvikle bakterie celler transporteres gradvis fra bunnen av seminiferous tubule mot lumen. Denne prosessen er regulert av celle-celle kontakter mellom bakterie celler og Sertoli celler1,2. Tilstøtende Sertoli cellene danner BTB som ligger nær bunnen av seminiferous tubule. BTB deler fysisk epitel i en basal og en adluminal rom. I fasen VIII – IX av epitelial syklusen, migrere preleptotene/leptotene spermatocytes fra de basale avdelinger over BTB, inn i adluminal rom3. Derfor er funksjonen av BTB å gi en immunoprivileged microenvironment for meiose og spermiogenesis4,5,6er fullført. I motsetning til andre blod-vev-barrierer (f.eks, blod – hjerne barrieren) som bare består av tett veikryss (TJs), er BTB dannet av fire forskjellige veikryss (TJs ectoplasmic spesialisering, gap veikryss og mellomliggende filament-basert desmosomes) mellom Sertoli celler1,7.
Mange studier har brukt genetisk endret mus, virusinfeksjoner og miljømessige giftstoffer for å undersøke mekanismer for BTB integritet7,8,9. BTB avbrudd induserer svekket spermatogenesis og subfertility eller infertilitet. Siden BTB dannelse og integriteten er bekreftet for kontakter mellom Sertoli celler8, en i vitro modell basert på primære kulturen i isolerte Sertoli celler har blitt brukt for BTB studie. Men kan ikke denne modellen nøyaktig etterligne BTB dynamics i vivo. Videre har ingen slike co kultur av bakterie celler med Sertoli celler blitt etablert som kan reflektere alle aktuelle strukturelle og funksjonelle komponenter BTB10,11.
Generelt, er i vivo BTB integritet analyser vanligvis basert på små molekyler, som EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin og FITC-konjugerte inulin (inulin-FITC). Normalt er spredningen av biotin eller inulin-FITC fra basale rommet blokkert av BTB struktur. Vi er derfor bruke denne metoden til å vurdere omfanget av BTB skade sammenlignet med kontroll grupper. Mens BTB kan bli svekket med visse typer stimuli, som behandling med kadmium klorid (CdCl2)12, blir BTB tilgjengelig for små molekyler, som til slutt angir adluminal rommet som indikatorer.
Tidlig i vivo BTB integritet analysen innebærer injisere biotin eller inulin-FITC i vena jugularis, som medfører kirurgi, og er invasiv, komplisert og tidkrevende. Dessuten som reporter stoffene diffus gjennom hele kroppen via sirkulasjon, er lokale konsentrasjonen av biotin eller inulin-FITC i de seminiferous tubules begrenset. Videre kan systemisk eksponering forårsake immunreaksjoner. Her presenterer vi en enkel og effektiv i vivo BTB integritet analysen muliggjør direkte injeksjon av en liten aliquot av inulin-FITC i interstitium av en testikkel. Bruke lysstoffrør merking metoden, er som om det praktisk, som sekundær antistoffer ikke er nødvendig. Her er prosessen med fluorescerende fargestoff inn testikkel visualisert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spermatogenesis foregår i seminiferous epitel og er en svært organisert og dynamisk prosess som styres av bakterie celler og somatiske celler (f.eks Sertoli celler)13. Den BTB strukturen, som er konstruert av Sertoli celler, deler seminiferous epitel i en basal og en apikale rom. Utviklingen av meiotic og haploid bakterie celler oppstår i apikale rommet som danner en immunologiske barriere14.
Funksjonen BTB kan kompromitteres…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National nøkkel R & D Program i Kina (2016YFA0500902), National Natural Science Foundation av Kina (31471228, 31771653), Jiangsu Science Foundation fremragende unge forskere (BK20150047), naturfag Jiangsu provinsen (BK20140897, 14KJA180005) og nyskapende og entreprenør programmet Jiangsu provinsen til K.Z.
Materials
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
Riferimenti
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
- Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).
- Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).
- O’Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?. Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
- Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).
- Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).
- Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).
- Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).
- Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).
- Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the ‘blood-testis barrier’ after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).
- Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
- Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).
- Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?. Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).
- Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).
- Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).
- Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).
- Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).
