Um método In Vivo para estudar a integridade de barreira de sangue-testículo de rato
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a integridade da barreira sangue-testículo injetando inulina-FITC em testículos. Este é um método eficiente na vivo para estudar a integridade de barreira sangue-testículo, que pode ser comprometida por elementos genéticos e ambientais.
Abstract
Espermatogênese é o desenvolvimento das espermatogónias em espermatozoides maduros nos túbulos seminíferos do testículo. Este processo é suportado por junções de células de Sertoli na barreira sangue-testículo (BTB), que é a barreira de tecido mais apertada no corpo dos mamíferos e segrega o epitélio seminífero em dois compartimentos, um basal e um adluminal. O BTB cria um microambiente exclusivo para as células germinativas em meiose eu / II e para o desenvolvimento de postmeiotic espermátides em espermatozoides através de acridina. Aqui, descrevemos um ensaio confiável para monitorar a integridade do BTB do rato testículo na vivo. Uma intacta BTB bloqueia a difusão de inulina FITC-Conjugado da basal para o compartimento apical dos túbulos seminíferos. Esta técnica é apropriada para o estudo de genes candidatos, vírus ou tóxicos ambientais que podem afetar a função do BTB ou integridade, com um procedimento fácil e de um requisito mínimo de habilidades cirúrgicas em comparação com métodos alternativos.
Introduction
Espermatogênese de mamíferos é considerado um processo altamente estruturado que engloba espermatogónias auto-renovação e diferenciação através de espermatócitos em espermatozoides haploides através de mitose e meiose acridina, durante o qual dramática ocorrem alterações bioquímicas e morfológicas. Desenvolvimento das células germinativas são progressivamente transportadas da base do túbulo seminífero em direção ao lúmen. Este processo é regulado pelo celular os contactos entre as células germinativas e células de Sertoli1,2. Células de Sertoli adjacentes formam o BTB que situa-se perto da base do túbulo seminífero. O BTB fisicamente divide o epitélio em um basal e um compartimento adluminal. Durante estágios VIII – IX do ciclo do epitélio, preleptotene/leptóteno espermatócitos de compartimentos do basais migram através do BTB, entrando o adluminal compartimentos3. Portanto, a função do BTB é fornecer um microambiente immunoprivileged a conclusão de meiose e acridina4,5,6. Ao contrário de outras sangue-tecido barreiras (por exemplo, barreira hemato – encefálica) que são compostas apenas de junções apertadas (TJs), o BTB é formado por quatro diferentes junções (TJs, especializações ectoplásmicas, junções e intermediário baseado no filamento desmossomas) entre Sertoli células1,7.
Muitos estudos utilizaram-se ratos geneticamente modificados, infecções por vírus e tóxicos ambientais para investigar mecanismos de BTB integridade7,8,9. O rompimento do BTB induz a espermatogênese prejudicada e Subfertilidade ou infertilidade. Desde a formação do BTB e integridade foram confirmados para ser afetado pelos contatos entre as células de Sertoli8, um modelo in vitro com base em cultura primária de células de Sertoli isoladas tem sido utilizado para o estudo do BTB. No entanto, este modelo exatamente não pode imitar BTB dinâmica em vivo. Além disso, não há tal co-cultura de células germinativas com células de Sertoli estabeleceu como capaz de refletir todos os componentes estruturais e funcionais relevantes do BTB10,11.
Em geral, ensaios de integridade em vivo BTB normalmente são baseados em pequenas moléculas, tais como o EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina e inulina conjugado FITC (inulina-FITC). Normalmente, a difusão da biotina ou inulina-FITC do compartimento basal é bloqueada pela estrutura do BTB. Portanto, somos capazes de usar esse método para avaliar a extensão do dano BTB em comparação com grupos de controle. Enquanto BTB pode ser comprometida com certos tipos de estímulos, tais como tratamento com cádmio cloreto (CdCl2)12, BTB torna-se acessível para pequenas moléculas, os quais acabaram por inserir o compartimento adluminal como indicadores.
Um início na vivo BTB integridade ensaio envolve a injeção de biotina ou inulina-FITC na veia jugular, que envolve a cirurgia e é invasiva, complicado e demorado. Além disso, como as substâncias repórter difundem por todo o corpo através da circulação, a concentração local de biotina ou inulina-FITC nos túbulos seminíferos é limitada. Além disso, a exposição sistémica pode induzir reações imunes. Aqui, apresentamos um simples e eficaz na vivo BTB integridade ensaio permitindo injeção direta de uma pequena alíquota de inulina-FITC para o interstício de um testículo. Usando o método de rotulagem fluorescente, o processo de coloração é conveniente, como anticorpos secundários não são necessários. Aqui, o processo de tintura fluorescente entrando o testículo é visualizado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Espermatogênese ocorre no epitélio seminífero e é um processo altamente ordenado e dinâmico que é regido por células germinativas e células somáticas (por ex., células de Sertoli)13. A estrutura do BTB, que é construída pelas células de Sertoli, divide o epitélio seminífero em um basal e um compartimento apical. O desenvolvimento das células germinativas haploides e meióticas ocorre no compartimento apical que forma uma barreira imunológica14</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela nacional chave R & D programa de China (2016YFA0500902), Nacional Natural Science Foundation da China (31471228, 31771653), a Fundação de ciência de Jiangsu para ilustres jovens estudiosos (BK20150047), a ciência Natural Fundação da província de Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) e o programa inovadora e empreendedorismo da província de Jiangsu para K.Z.
Materials
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
Riferimenti
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