En In Vivo -Metod för att studera mus blod-Testis barriär integritet
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma den blod-testis-barriär integriteten genom att injicera inulin-FITC i testiklarna. Detta är en effektiv i vivo metod att studera blod-testis-barriären integritet som kan äventyras av genetiska och miljömässiga faktorer.
Abstract
Spermatogenesen är utvecklingen av spermatogonier till mogna spermier i sädeskanalerna i testiklarna. Denna process stöds av Sertoli celler korsningar på den blod-testis-barriären (BTB), som är snäv vävnad barriären i däggdjur kroppen och segregerar sädesproducerande epitel i två fack, en basal och en adluminal. BTB skapar en unik närmiljön för könsceller i meios I / II och för utvecklingen av postmeiotic spermatids till spermier via spermiogenesis. Här beskriver vi en tillförlitlig test för att övervaka BTB integritet mus testiklarna i vivo. En intakt BTB blockerar diffusionen av FITC-konjugerad inulin från den basala i apikala facket av sädeskanalerna. Denna teknik är lämplig för att studera genen kandidater, virus eller miljögifter som kan påverka BTB funktion eller integritet, med ett enkelt förfarande och ett minimalt krav på kirurgisk kompetens jämfört med alternativa metoder.
Introduction
Däggdjur spermatogenes anses vara en mycket strukturerad process som omfattar spermatogoniala självförnyelse och differentiering genom spermatocyter in haploida spermier via Mitos, meios och spermiogenesis, under vilken dramatisk biokemiska och morfologiska förändringar inträffar. Utveckla könsceller transporteras gradvis från basen av de seminifera tubuli mot lumen. Denna process regleras av cell-cell kontakter mellan könsceller och Sertoli celler1,2. Angränsande Sertoli celler bildar den BTB som ligger nära basen av de seminifera tubuli. BTB delar fysiskt epitelet i en basal och en adluminal fack. Under skeden VIII – IX av epitelial cykeln, migrerar preleptotene/leptotene spermatocyter från de basala fack över de BTB, in adluminal fack3. Funktionen av BTB därför att ge en immunoprivileged närmiljön för slutförandet av meios och spermiogenesis4,5,6. Till skillnad från andra blod-vävnad hinder (t.ex., blod – hjärnbarriären) som endast består av åtsittande föreningspunkter (TJs), bildas BTB av fyra olika korsningar (TJs, ektoplasmiskt inriktningar, gap-junctions och intermediär filament-baserade desmosomes) mellan Sertoli celler1,7.
Många studier har använt genetiskt modifierade möss, virusinfektioner och miljögifter för att undersöka mekanismer BTB integritet7,8,9. BTB störningar inducerar försämrad spermatogenes och stamcellsforskningen eller infertilitet. Eftersom BTB bildning och integritet har bekräftats för att påverkas av kontakter mellan Sertoli celler8, en in vitro- modell baserad på primära kultur av isolerade Sertoli celler har använts för BTB studie. Denna modell inte kan dock noggrant efterlikna BTB dynamics in vivo. Dessutom har ingen sådan samtidig kultur av könsceller med Sertoli celler etablerats som kan återspegla alla relevanta strukturella och funktionella komponenter i BTB10,11.
I allmänhet baseras i vivo BTB integritet analyser vanligtvis på små molekyler, såsom EZ-anknyter Sulfo-NHS-LC-Biotin och FITC-konjugerad inulin (inulin-FITC). Normalt blockeras av biotin eller inulin-FITC från den basala kupén diffusion av BTB struktur. Därför är vi kunna använda denna metod för att bedöma omfattningen av BTB skador jämfört med kontrollgrupperna. Medan BTB kan äventyras med vissa typer av stimuli, såsom behandling med kadmium klorid (CdCl2)12, blir BTB tillgänglig för små molekyler, som så småningom in i adluminal facket som indikatorer.
Ett tidigt i vivo BTB integritet test innebär att injicera biotin eller inulin-FITC i halsvenen, som innebär kirurgi och invasiva, komplicerade och tidskrävande. Förutom, som reporter ämnen diffunderar genom hela kroppen via cirkulationen, lokala koncentrationen av biotin eller inulin-FITC i sädeskanalerna är begränsad. Systemisk exponering kan dessutom framkalla immuna reaktioner. Här presenterar vi en enkel och effektiv i vivo BTB integriteten analysen möjliggör direkt injektion av en liten alikvot av inulin-FITC i interstitium av en testikel. Använder den fluorescerande märkning metoden, är färgning processen bekvämt, eftersom sekundära antikroppar inte krävs. Här är processen av fluorescerande färgämne in testiklarna visualiseras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spermatogenes sker i de sädesproducerande epitelet och är en mycket ordnad och dynamisk process som styrs av könsceller och somatiska celler (t.ex., Sertoli celler)13. BTB struktur, som är konstruerad av Sertoli celler, delar av sädesproducerande epitel i en basal och en apikal fack. Utvecklingen av meiotiska och haploida könsceller uppstår i apikala facket som bildar en immunologisk barriär14.
Funktionen BTB kan äventy…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick stöd av den nationella tangenten R & D Program i Kina (2016YFA0500902), den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (31471228, 31771653), Stiftelsen Jiangsu vetenskap för framstående unga forskare (BK20150047), den naturliga vetenskapen Grunden i Jiangsu-provinsen (BK20140897, 14KJA180005) och programmet innovativa och entreprenöriella i Jiangsu-provinsen till K.Z.
Materials
| Capillary puller | SUTTER INSTRUMENT (USA) | P-97 | |
| 10x PBS | Hyclone (USA) | SH30258.01 | dilution to 1× in ddH2O |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma (USA) | F6057 | |
| Adhesion microscope slides | CITOGLAS (China) | 80312-3161 | |
| Cadmium chloride | Sigma (USA) | 655198-5G | |
| Confocal microscope | Zeiss (Germany) | LSM700 | |
| Dust-free paper | Kimberly-Clark (USA) | 34120 | |
| Inulin-FITC | Sigma (USA) | F3272 | |
| Microinjection capillaries | Zhengtianyi (China) | BJ-40 | 1.0 mm × 0.8 mm × 100 mm |
| Micropipette beveler | NARISHIGE (JAPAN) | EG-400 | |
| OCT | SAKURA (JAPAN) | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma (USA) | P6148 | |
| Pentobarbital sodium | Merck (Germany) | P11011 | |
| Shaver | Yashen (China) | ||
| Stereo microscope | Nikon (JAPAN) | SMZ1000 | |
| Sucrose | Sangon Biotech (China) | A610498 | |
| Surgical instruments | Stronger (China) | scissors, forceps, needle holder | |
| Syringe | KDL (China) | 20163150518 | 0.45 mm × 0.16 mm RW LB |
| thermostatic heater | KELL (Nanjing, China) | KEL-2010 | |
| 10x TBS, pH 7.6 | |||
| 0.2 M Tris | Sangon Biotech (China) | A600194 | |
| 1.37 M Nacl | Sangon Biotech (China) | A610476 |
Riferimenti
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).
- Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4 (4), e1265042 (2016).
- Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).
- O’Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?. Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
- Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).
- Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).
- Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).
- Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).
- Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).
- Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the ‘blood-testis barrier’ after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).
- Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
- Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).
- Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?. Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).
- Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).
- Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93 (6), 139 (2015).
- Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).
- Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).
