Samtidiga kryosnitt av flera gnagare hjärnor
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att frysa och avsnitt hjärnvävnad från flera djur som en tidsbesparande alternativ till bearbetning enda hjärnor. Detta minskar färgning variabilitet under immunohistokemi och minskar tid kryosnitt och imaging.
Abstract
Histologi och immunohistokemi är rutinmässiga analysmetoder för att visualisera mikroskopisk anatomi och lokalisera proteiner inom biologisk vävnad. I neurovetenskap, samt en uppsjö av andra vetenskapliga områden används dessa tekniker. Immunohistokemi kan göras på bilden monterad vävnad eller friflytande sektioner. Förbereda bilden monterade prover är en dags intensiv process. Följande protokoll för en teknik, som kallas Megabrain, minskas den tid som upp till 90% till cryosection och montera hjärnvävnad genom att kombinera flera hjärnor i ett enda frysta block. Denna teknik minskar dessutom variabilitet sett mellan färgning rundor, i en stor histochemical studie. Den nuvarande tekniken har optimerats för att använda gnagare hjärnvävnad i nedströms immunhistokemiska analyser; dock kan det tillämpas olika vetenskapliga fält som använder kryosnitt.
Introduction
Här presenterar vi protokollet för en ny metod, som vi kallar Megabrain, framkallade till cryosection flera gnagare brains samtidigt för nedströms immunhistokemisk förfaranden. En Megabrain möjliggör produktion av enstaka bilder som innehåller vävnad från flera djur. Denna teknik har optimerats för att skära koronalt avsnitt från 9 vuxen råtta halvklot, eller 5 vuxna full hjärnor, samtidigt. Tekniken är därför mest tillämplig i stora immunhistokemiska studier eller andra analyser som gjort på bilden monterad hjärnvävnad från en stor kohort av djur.
Immunohistokemi innebär användning av specifika antikroppar riktade mot proteiner av intresse att förstå och karakterisera deras uttryck och cellförändringar i vävnad1,2,3. Användning av immunhistokemi är utbredd inom neurovetenskap, bland andra vetenskapliga discipliner, medhjälp i cellulär och molekylär förståelse av hjärnan4. Storskaliga studier med många djur och hjärnan sektioner kan vara både resurser och tid intensivt. Som sådan, det är en mångfacetterad logiken bakom utvecklingen av Megabrain: att minska tid tillbringade kryosnitt, montering och färgning vävnad, medan följaktligen använder mindre reagenser. Dessutom möjligheten att effektivisera processen och fläcken flera hjärnor i samma runda hjälper till att lindra en del av variabiliteten mellan färgning partier, en begränsning av immunhistokemi3. Dessutom snittning en Megabrain är ett tidsbesparande alternativ till snittning enskilda frusna gnagare hjärnor och möjliggör snabb jämförelse av vävnaden mellan djur eller ens behandlingsgrupperna genom mikroskopi tekniker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det bör övervägas under detta förfarande att Megabrain och dess omgivningar temperatur ständigt måste övervakas för att förhindra upptining och åter frysning av vävnad. Hjärnan kan bara tas bort från-20 ° C frysen upp till 3 gånger som varje gång det är rörd och vänster i kryostaten, med varmare fluktuerande feber, vävnaden tinar och fryser, orsakar en gelé som textur och onormal vävnad integritet10. Därför är det optimalt att klippa Megabrain alla på en gång.
<p cla…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCH uppdrag stödfonder stöds forskningen rapporterade detta manuskript. Författarna vill tacka Daniel Griffiths för att ta de bilder som används i siffrorna.
Materials
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) – white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
Riferimenti
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?. Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
- Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).
