Cryosectioning simultánea de varios cerebros de roedores
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de congelación y sección de tejido cerebral de varios animales como una alternativa de ahorro de tiempo a procesar solo cerebros. Esto reduce la variabilidad de coloración durante la inmunohistoquímica y reduce la proyección de imagen y tiempo cryosectioning.
Abstract
Histología e inmunohistoquímica son métodos de rutina de análisis para visualizar la anatomía microscópica y localizar proteínas en tejido biológico. En neurociencia, así como una plétora de otros campos científicos, se utilizan estas técnicas. Inmunohistoquímica puede hacerse en tejido deslizante montado o secciones flotan libremente. Preparación de muestras de diapositivas es un proceso intensivo de tiempo. El siguiente protocolo para una técnica, llamada el Megabrain, reduce el tiempo necesario para montaje y criosección tejido cerebral hasta un 90% mediante la combinación de varios cerebros en un solo bloque congelado. Además, esta técnica reduce la variabilidad entre rondas, en un gran estudio histoquímico de la coloración. La técnica actual se ha optimizado para el uso de tejido cerebral de roedor en el análisis de immunohistochemical aguas abajo; sin embargo, puede aplicarse a distintos campos científicos que utilizan cryosectioning.
Introduction
Aquí, presentamos el protocolo para un nuevo método, que llamamos Megabrain, convertido a criosección roedor múltiples cerebros al mismo tiempo para los procedimientos de inmunohistoquímica aguas abajo. Un Megabrain permite la producción de diapositivas individuales que contienen tejido de múltiples animales. Esta técnica ha sido optimizada para cortar secciones coronales de hemisferios de rata adulta 9 o 5 cerebros completos adulto, al mismo tiempo. Por lo tanto, la técnica es más aplicable en los estudios de immunohistochemical grandes o en otros análisis realizados en tejido de cerebro montada diapositiva de una cohorte grande de animales.
Immunohistochemistry implica el uso de anticuerpos específicos dirigidos contra proteínas de interés para entender y caracterizar su expresión y cambios celulares en el tejido específico1,2,3. El uso de la inmunohistoquímica es frecuente en la investigación de la neurociencia, entre otras disciplinas científicas, ayudando en la comprensión celular y molecular del cerebro4. Estudios a gran escala con muchos animales y secciones del cerebro pueden ser intensivo de tiempo y recursos. Como tal, existe una razón multifacético detrás del desarrollo de lo Megabrain: reducir el tiempo dedicado cryosectioning, montaje y tinción de tejidos, mientras que, en consecuencia, menos reactivos. Además, la capacidad de agilizar el proceso y varios cerebros en el mismo la mancha redonda ayuda a aliviar parte de la variabilidad entre lotes, una limitación de inmunohistoquímica3la coloración. Además, seccionar un Megabrain es una alternativa de ahorro de tiempo al seccionamiento cerebros de roedores congelados individuales y permite la comparación rápida de tejido entre animales o incluso grupos de tratamiento por técnicas de microscopía.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante este procedimiento, debe considerar que la temperatura de lo Megabrain y sus alrededores debe ser constantemente monitoreada para evitar descongelar y volver a congelar el tejido. El cerebro puede sólo retirarse del congelador de-20 ° C hasta a 3 veces cada vez que se toca y de izquierda en el criostato, con una temperatura fluctuante más cálida, el tejido se descongela y refreezes, causando una jalea como textura y tejido anormal integridad10. Por lo tanto, es óptimo para cortar el M…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fondos de apoyo de la misión de PCH apoyó la investigación en este manuscrito. Los autores desean agradecer a Daniel Griffiths por tomar las imágenes utilizadas en las figuras.
Materials
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) – white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
Riferimenti
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