Cryosectioning בו זמנית של המוח מכרסמים מרובים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול הקפאה של סעיף רקמת מוח מחיות מרובים כחלופה ייעול עיבוד המוח יחיד. זה מפחית את השתנות מכתימים במהלך אימונוהיסטוכימיה, מפחית את הזמן cryosectioning והדמיה.
Abstract
היסטולוגיה אימונוהיסטוכימיה שיטות שגרתיות של ניתוח כדי להמחיש אנטומיה מיקרוסקופיים, בתרגום חלבונים בתוך רקמה ביולוגית בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. מדעי המוח, כמו גם למגוון רחב של תחומים מדעיים אחרים, טכניקות אלו משמשים. אימונוהיסטוכימיה יכול להיעשות על שקופית רכוב רקמות או מקטעים לתרשים. הכנת דוגמאות רכוב שקופיות הוא תהליך אינטנסיבי זמן. פרוטוקול הבאים עבור טכניקה, קרא את Megabrain, מופחת לוקחים את הזמן כדי cryosection ו הר רקמת המוח על ידי 90% על-ידי שילוב המוחות מרובים לתוך בלוק קפוא יחיד. יתר על כן, טכניקה זו הקטינה השתנות ראיתי בין מכתים סיבובים, במחקר פתולוגיה גדולים. הטכניקה הנוכחי הותאם לשימוש רקמת המוח מכרסמים בניתוחים immunohistochemical במורד הזרם; עם זאת, ניתן להחיל אותה על תחומים מדעיים שונים, להשתמש cryosectioning.
Introduction
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול שיטה, אשר נקרא Megabrain, פותח על מנת cryosection מכרסם מרובים המוח במקביל להליכי immunohistochemical במורד הזרם. Megabrain מאפשר הייצור של שקופיות יחיד המכיל רקמות מחיות מרובים. טכניקה זו מוטבה לחתוך קטעים הילתית ההמיספרות עכברים בוגרים 9, או 5 מבוגרים. המוח מלא, בו זמנית. לכן, הטכניקה ישימה ביותר ללימודי immunohistochemical גדולים או ניתוחים אחרים שנעשה על רקמת המוח רכוב שקופיות מתוך קבוצה גדולה של בעלי חיים.
אימונוהיסטוכימיה כרוכה בשימוש של נוגדנים ספציפיים נגד חלבונים לעניין להבין ולאפיין שלהם ביטוי ושינויים סלולר רקמות ספציפיות1,2,3. השימוש אימונוהיסטוכימיה נפוצה במחקר מדעי המוח, בין דיסציפלינות מדעיות אחרים, מסייע בהבנה תאית ומולקולרית של המוח4. מחקרים רחבי היקף שכללו חיות רבות ומקטעים המוח יכול להיות אינטנסיבי בזמן והן משאבים. ככזה, יש תירוץ רבת מאחורי התפתחות Megabrain: כדי לצמצם את זמן בילה cryosectioning, הרכבה, צביעת רקמות, תוך שימוש כתוצאה מכך ריאגנטים פחות. יתר על כן, היכולת לייעל את התהליך כתם המוח מרובים באותו סיבוב מסייע להקל על חלק של השונות בין מכתים אצוות, מגבלה של אימונוהיסטוכימיה3. בנוסף, חלוקתה של Megabrain היא אלטרנטיבה חיסכון בזמן חלוקתה בודדים המוח מכרסמים קפוא ומאפשר השוואה מהירה של רקמות בין חיות או אפילו קבוצות הטיפול על ידי טכניקות במיקרוסקופ.
Protocol
Representative Results
Discussion
זה יש לקחת בחשבון במהלך הליך זה כי הטמפרטורה של Megabrain וסביבתו חייב להיות פיקוח מתמיד כדי למנוע מפשיר, הקפאה מחדש של הרקמה. המוח ניתן להסיר מהמקפיא-20 ° C עד כדי 3 פעמים כמו בכל פעם. אל תיגע, ב cryostat, עם תנודות טמפרטורה חמה יותר, הרקמה מפשירה על ימין ועל שמאל refreezes, גורם ריבה כמו מרקם של רקמה נורמלית…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCH המשימה תמיכה קרנות תמיכה המחקר דיווח בכתב היד. המחברים רוצה להודות דניאל גריפיתס לקחת את התמונות בשימוש הדמויות.
Materials
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) – white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
Riferimenti
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?. Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
- Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).
