Здесь мы представляем протокол для визуализации, обнаружения, анализа и отслеживания эндогенной торговли мРНК в живой дрозофилальной меланогастерской яичной камере с использованием молекулярных маяков, вращающейся дисковой конфокальной микроскопии и анализа с открытым исходным кодом Программного обеспечения.
Методы визуализации на основе флуоресценции, в сочетании с разработками в области световой микроскопии, произвели революцию в том, как клеточные биологи проводят исследования живой визуализации клеток. Методы обнаружения РНК значительно расширились, так как семенные исследования связывали локализацию мРНК с регулированием экспрессии генов. Динамические процессы мРНК теперь могут быть визуализированы с помощью подходов, которые обнаруживают мРНК, в сочетании с микроскопией настройки, которые достаточно быстро, чтобы захватить динамический диапазон молекулярного поведения. Технология молекулярного маяка представляет собой подход, основанный на гибридизации, способный непосредственно обнаруживать эндогенные транскрипты в живых клетках. Молекулярные маяки – это шпильки, внутренне утопленные, однонуклеотидные дискриминирующих нуклеиновой кислоты зонды, которые флуоресцируют только при гибридизации в уникальную целевую последовательность. В сочетании с передовой флуоресценционной микроскопией и изображениями с высоким разрешением они позволяют выполнять пространственное и временное отслеживание внутриклеточного движения мРНК. Хотя эта технология является единственным методом, способным обнаруживать эндогенные транскрипты, клеточные биологи еще не полностью приняли эту технологию из-за трудностей в проектировании таких зондов для визуализации живых клеток. Новое программное приложение, PinMol, позволяет для расширения и быстрого проектирования зондов лучше всего подходит для эффективной гибридизации мРНК целевых регионов в живой клетке. Кроме того, высокое разрешение, приобретение изображений в реальном времени и текущее программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом позволяют проводить уточненные данные, что позволяет более точно оценить сложность динамических процессов, лежащих в жизненном цикле мРНК.
Здесь мы представляем всеобъемлющий протокол для проектирования и доставки молекулярных маяков в Дрозофила меланогастер яйцеклеток. Прямое и высокоспецифическое обнаружение и визуализация эндогенных материнских мРНК осуществляется с помощью вращающейся дисковой конфокальной микроскопии. Данные визуализации обрабатываются и анализируются с помощью обнаружения и отслеживания объектов в программном обеспечении Icy для получения подробной информации о динамическом движении мРНК, которые транспортируются и локализуются в специализированные регионы в пределах яйцеклетки.
Исследования клеточной биологии, которые визуализируют динамические события с пространственным и временным разрешением, стали возможными благодаря развитию методов визуализации живых клеток на основе флуоресценции. В настоящее время, in vivo мРНК визуализация достигается с помощью технологий, которые основаны на РНК aptamer-белковых взаимодействий, РНК аптамер индуцированной флуоресценции органических красителей и нуклеиновой кислоты зонд annealing1,2, 3. Все они предлагают высокую специфичность, чувствительность и соотношение сигнала к фону. Тем не менее, РНК aptamer-ориентированных подходов требуют обширных генетических манипуляций, где трансген инженерии, чтобы выразить РНК с искусственными структурными мотивами, которые необходимы для белка или органических связывания красителя. Например, система MS2/MCP требует совместного выражения трансгена, выражающего конструкцию РНК, содержащую несколько тандемных повторов связывающей последовательности для белка покрытия бактериофага MS2 (MCP), и другого трансгена, кодирующего флуоресцентный белок сливается с MCP4,5. Добавление таких вторичных структурных мотивов в РНК, наряду с громоздким флуоресцентно помечены белка, вызвало опасения, что родные процессы РНК могут быть затронуты6. Технология, которая решает эту проблему и предлагает дополнительные уникальные преимущества, это подход на основе нуклеиновой кислоты, молекулярные маяки (МБ). МБ позволяют мультиплексное обнаружение эндогенных мРНК, дискриминацию однонуклеотидных вариаций ибыструю кинетику гибридизации с целевой мРНК 7,8. МБ являются олигонуклеотидных зондов, которые остаются в утоленной шпильки раза до прохождения фторгенных конформационных изменений, как только они гибридизируются к своим целям (Рисунок 1C)9. Несколько групп имели успех в использовании МБ для обнаружения как некодирующих РНК (микроРНК и lncRNAs)10,11,12,13, РНК ретровирусов14 и динамических ДНК-белков взаимодействия15. Они были успешно использованы для визуализации в различных организмах и тканях, таких как эмбрионы зебры16, нейроны13, опухолевая ткань17, дифференциационирование кардиомиоцитов18, и сальмонеллы 19.
Здесь мы описываем дизайн, доставка и обнаружение подход для эндогенных мРНК в жизни D. melanogaster яичные камеры в сочетании с микроскопией настройки, которая достаточно быстро, чтобы захватить динамический диапазон активного молекулярного транспорта. D. melanogaster яичная камера служила в качестве идеальной многоклеточной модели системы для широкого спектра исследований в области развития, от раннего зародышевой деления стволовых клеток и выражение материнского гена к поколению сегментарного плана тела20, 21. Яичные камеры легко изолированы, большие и полупрозрачные, и способны выдерживать часы анализа ex vivo, что делает их высоко поддаются воображению экспериментов. До активного перевода была проработана большая работа по асимметричной локализации материнских стенограмм в отдельные субклеточные области. В частности, локализация Оскарм мРНК и его последующий перевод на задний полюс ооцита должны происходить в строго регламентированной манере, чтобы избежать смертельного бидаудального эмбриона фенотипа22. Оскар мРНК транскрибируется в 15 зародышевых клеток, называемых клетками медсестры, и активно транспортируется через цитоплазмамические мосты, называемые кольцевыми каналами, в яйцеклетку, зародышевую клетку, которая становится зрелой яйцеклеткой и в конечном счете оплодотворяется (Рисунок 1A ). Значительный объем информации, уже имеющейся в отношении динамичного набора и обмена белковыми факторами и из Oskar mRNP, наряду с его дальними внутриклеточными поездками, делает Оскара предпочтительным кандидатом на учебу многие процессы жизненного цикла мРНК. МБ сыграли важную роль в раскрытии деталей о процессе локализации мРНК и расшифровке регуляции и функции белковых факторов, контролирующих перенос мРНК во время дрозофилы oogenesis. В частности, путем микроинъекцииЯ МБ в клетки медсестры и выполнения экспериментовпо визуализации живых клеток, отслеживание эндогенных мРНК возможно 8,23.
Представленная здесь дорожная карта предлагает шаги полного процесса, от проведения эксперимента по визуализации живых клеток с использованием МБ, получения данных изображений, до проведения анализа данных для отслеживания эндогенной мРНК в своей родной клеточной среде. Шаги могут быть изменены и дополнительно оптимизированы для удовлетворения потребностей исследователей, работающих с другими типами тканей/клеток в их собственной лабораторной обстановке.
Восновенизация эндогенной мРНК в яичных камерах Drosophila опирается на использование специфических, эффективных и устойчивых к нуклеаде МБ, которые теперь могут быть легко разработаны с помощью программного обеспечения PinMol. МБ представляют собой специфические зонды, предназна?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Сальваторе А.Е. Маррас (Центр Научно-исследовательского института общественного здравоохранения, Ратгерский университет) за синтез, маркировку и очищение молекулярных маяков, а Даниэля Сент-Джонстона (Гурдонский институт, Кембриджский университет) за оскар-MS2/ McP-GFP трансгенных мухи запасов. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом CAREER Award 1149738 и премией Конгресса профессионального персонала-CUNY Для DPB.
Spectrofluorometer | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | Photon counting spectrofluorometer |
Quartz cuvette | Fireflysci (former Precision Cells Inc.) | 701MFL | |
Dumont #5 tweezer | World Precision Instruments | 501985 | Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
Cover slip No.1 22 x 40mm | VWR | 48393-048 | |
Dissecting microscope | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
CO2 fruit fly anesthesia pad | Genesee Scienific | 59-114 | |
Tris-HCL pH7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
Spinning disc confocal microscope | Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. | n/a | |
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera | Hamamatsu | n/a | |
PatchMan NP 2 Micromanipulator | Eppendorf Inc. | 920000037 | |
FemtoJet Microinjector | Eppendorf Inc. | 920010504 | |
Injection needle: Femtotips II | Eppendorf Inc. | 930000043 | |
Loading tip: 20ul Microloader | Eppendorf Inc. | 930001007 | |
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
Dry yeast | Any grocery store | n/a | |
Computer, > 20 GB RAM | Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing |