Визуализация и отслеживание эндогенных мРНК в Live Drosophila меланогастер яйцо палаты
Summary
Здесь мы представляем протокол для визуализации, обнаружения, анализа и отслеживания эндогенной торговли мРНК в живой дрозофилальной меланогастерской яичной камере с использованием молекулярных маяков, вращающейся дисковой конфокальной микроскопии и анализа с открытым исходным кодом Программного обеспечения.
Abstract
Методы визуализации на основе флуоресценции, в сочетании с разработками в области световой микроскопии, произвели революцию в том, как клеточные биологи проводят исследования живой визуализации клеток. Методы обнаружения РНК значительно расширились, так как семенные исследования связывали локализацию мРНК с регулированием экспрессии генов. Динамические процессы мРНК теперь могут быть визуализированы с помощью подходов, которые обнаруживают мРНК, в сочетании с микроскопией настройки, которые достаточно быстро, чтобы захватить динамический диапазон молекулярного поведения. Технология молекулярного маяка представляет собой подход, основанный на гибридизации, способный непосредственно обнаруживать эндогенные транскрипты в живых клетках. Молекулярные маяки – это шпильки, внутренне утопленные, однонуклеотидные дискриминирующих нуклеиновой кислоты зонды, которые флуоресцируют только при гибридизации в уникальную целевую последовательность. В сочетании с передовой флуоресценционной микроскопией и изображениями с высоким разрешением они позволяют выполнять пространственное и временное отслеживание внутриклеточного движения мРНК. Хотя эта технология является единственным методом, способным обнаруживать эндогенные транскрипты, клеточные биологи еще не полностью приняли эту технологию из-за трудностей в проектировании таких зондов для визуализации живых клеток. Новое программное приложение, PinMol, позволяет для расширения и быстрого проектирования зондов лучше всего подходит для эффективной гибридизации мРНК целевых регионов в живой клетке. Кроме того, высокое разрешение, приобретение изображений в реальном времени и текущее программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом позволяют проводить уточненные данные, что позволяет более точно оценить сложность динамических процессов, лежащих в жизненном цикле мРНК.
Здесь мы представляем всеобъемлющий протокол для проектирования и доставки молекулярных маяков в Дрозофила меланогастер яйцеклеток. Прямое и высокоспецифическое обнаружение и визуализация эндогенных материнских мРНК осуществляется с помощью вращающейся дисковой конфокальной микроскопии. Данные визуализации обрабатываются и анализируются с помощью обнаружения и отслеживания объектов в программном обеспечении Icy для получения подробной информации о динамическом движении мРНК, которые транспортируются и локализуются в специализированные регионы в пределах яйцеклетки.
Introduction
Исследования клеточной биологии, которые визуализируют динамические события с пространственным и временным разрешением, стали возможными благодаря развитию методов визуализации живых клеток на основе флуоресценции. В настоящее время, in vivo мРНК визуализация достигается с помощью технологий, которые основаны на РНК aptamer-белковых взаимодействий, РНК аптамер индуцированной флуоресценции органических красителей и нуклеиновой кислоты зонд annealing1,2, 3. Все они предлагают высокую специфичность, чувствительность и соотношение сигнала к фону. Тем не менее, РНК aptamer-ориентированных подходов требуют обширных генетических манипуляций, где трансген инженерии, чтобы выразить РНК с искусственными структурными мотивами, которые необходимы для белка или органических связывания красителя. Например, система MS2/MCP требует совместного выражения трансгена, выражающего конструкцию РНК, содержащую несколько тандемных повторов связывающей последовательности для белка покрытия бактериофага MS2 (MCP), и другого трансгена, кодирующего флуоресцентный белок сливается с MCP4,5. Добавление таких вторичных структурных мотивов в РНК, наряду с громоздким флуоресцентно помечены белка, вызвало опасения, что родные процессы РНК могут быть затронуты6. Технология, которая решает эту проблему и предлагает дополнительные уникальные преимущества, это подход на основе нуклеиновой кислоты, молекулярные маяки (МБ). МБ позволяют мультиплексное обнаружение эндогенных мРНК, дискриминацию однонуклеотидных вариаций ибыструю кинетику гибридизации с целевой мРНК 7,8. МБ являются олигонуклеотидных зондов, которые остаются в утоленной шпильки раза до прохождения фторгенных конформационных изменений, как только они гибридизируются к своим целям (Рисунок 1C)9. Несколько групп имели успех в использовании МБ для обнаружения как некодирующих РНК (микроРНК и lncRNAs)10,11,12,13, РНК ретровирусов14 и динамических ДНК-белков взаимодействия15. Они были успешно использованы для визуализации в различных организмах и тканях, таких как эмбрионы зебры16, нейроны13, опухолевая ткань17, дифференциационирование кардиомиоцитов18, и сальмонеллы 19.
Здесь мы описываем дизайн, доставка и обнаружение подход для эндогенных мРНК в жизни D. melanogaster яичные камеры в сочетании с микроскопией настройки, которая достаточно быстро, чтобы захватить динамический диапазон активного молекулярного транспорта. D. melanogaster яичная камера служила в качестве идеальной многоклеточной модели системы для широкого спектра исследований в области развития, от раннего зародышевой деления стволовых клеток и выражение материнского гена к поколению сегментарного плана тела20, 21. Яичные камеры легко изолированы, большие и полупрозрачные, и способны выдерживать часы анализа ex vivo, что делает их высоко поддаются воображению экспериментов. До активного перевода была проработана большая работа по асимметричной локализации материнских стенограмм в отдельные субклеточные области. В частности, локализация Оскарм мРНК и его последующий перевод на задний полюс ооцита должны происходить в строго регламентированной манере, чтобы избежать смертельного бидаудального эмбриона фенотипа22. Оскар мРНК транскрибируется в 15 зародышевых клеток, называемых клетками медсестры, и активно транспортируется через цитоплазмамические мосты, называемые кольцевыми каналами, в яйцеклетку, зародышевую клетку, которая становится зрелой яйцеклеткой и в конечном счете оплодотворяется (Рисунок 1A ). Значительный объем информации, уже имеющейся в отношении динамичного набора и обмена белковыми факторами и из Oskar mRNP, наряду с его дальними внутриклеточными поездками, делает Оскара предпочтительным кандидатом на учебу многие процессы жизненного цикла мРНК. МБ сыграли важную роль в раскрытии деталей о процессе локализации мРНК и расшифровке регуляции и функции белковых факторов, контролирующих перенос мРНК во время дрозофилы oogenesis. В частности, путем микроинъекцииЯ МБ в клетки медсестры и выполнения экспериментовпо визуализации живых клеток, отслеживание эндогенных мРНК возможно 8,23.
Представленная здесь дорожная карта предлагает шаги полного процесса, от проведения эксперимента по визуализации живых клеток с использованием МБ, получения данных изображений, до проведения анализа данных для отслеживания эндогенной мРНК в своей родной клеточной среде. Шаги могут быть изменены и дополнительно оптимизированы для удовлетворения потребностей исследователей, работающих с другими типами тканей/клеток в их собственной лабораторной обстановке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Восновенизация эндогенной мРНК в яичных камерах Drosophila опирается на использование специфических, эффективных и устойчивых к нуклеаде МБ, которые теперь могут быть легко разработаны с помощью программного обеспечения PinMol. МБ представляют собой специфические зонды, предназна?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Сальваторе А.Е. Маррас (Центр Научно-исследовательского института общественного здравоохранения, Ратгерский университет) за синтез, маркировку и очищение молекулярных маяков, а Даниэля Сент-Джонстона (Гурдонский институт, Кембриджский университет) за оскар-MS2/ McP-GFP трансгенных мухи запасов. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом CAREER Award 1149738 и премией Конгресса профессионального персонала-CUNY Для DPB.
Materials
| Spectrofluorometer | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | Photon counting spectrofluorometer |
| Quartz cuvette | Fireflysci (former Precision Cells Inc.) | 701MFL | |
| Dumont #5 tweezer | World Precision Instruments | 501985 | Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Cover slip No.1 22 x 40mm | VWR | 48393-048 | |
| Dissecting microscope | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| CO2 fruit fly anesthesia pad | Genesee Scienific | 59-114 | |
| Tris-HCL pH7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Spinning disc confocal microscope | Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera | Hamamatsu | n/a | |
| PatchMan NP 2 Micromanipulator | Eppendorf Inc. | 920000037 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf Inc. | 920010504 | |
| Injection needle: Femtotips II | Eppendorf Inc. | 930000043 | |
| Loading tip: 20ul Microloader | Eppendorf Inc. | 930001007 | |
| Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
| Dry yeast | Any grocery store | n/a | |
| Computer, > 20 GB RAM | Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing |
Riferimenti
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
- Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5′ to 3′ degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
- Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
- Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
- Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
- Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
- Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
- Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).
- Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626 (2014).
- Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
- Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
- Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
- Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
- Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
- Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97 (2009).
- McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
- Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).
- Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
- Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).
- Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
- Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
- Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
- Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2′-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).
- Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).
- Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
- Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962 (2015).
