Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme
Summary
Burada, moleküler işaretleri kullanarak canlı Drosophila melanogaster yumurta odasında endojen mRNA kaçakçılığı görselleştirme, algılama, analiz ve izleme için bir protokol sunuyoruz, iplik disk konfokka mikroskopi, ve açık kaynak Analizi Yazılım.
Abstract
Floresan bazlı görüntüleme teknikleri, ışık Mikroskopisinde gelişmelerle birlikte, hücre biyologlarının canlı hücre görüntüleme çalışmaları konusunda devrim yarattı. RNAs algılama yöntemleri, seminal çalışmalarda siteye özel mRNA lokalizasyonu ile gen ifadesi yönetmeliğine bağlı olarak büyük ölçüde genişledi. Dinamik mRNA süreçleri artık mRNAs ‘ı algılayan yaklaşımlar aracılığıyla, dinamik moleküler davranış aralığını yakalamak için yeterince hızlı olan mikroskopi ayarlarıyla birlikte görselleştirilebilir. Moleküler işaret teknolojisi, yaşayan hücrelerde endojen transkriptleri doğrudan tespit edebilen bir hybridizasyon tabanlı bir yaklaşımdır. Moleküler işaretler, yalnızca benzersiz bir hedef dizisine hibridizasyon üzerine floresan olan, saç iğne şeklinde, dahili olarak bastırılmış, tek nüklotid ayrımcılık nüklenik asit probları vardır. Gelişmiş Floresan mikroskopisi ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile birleştiğinde, mRNAs ‘ın hücre içi hareketinin uzamsal ve temporal takibini gerçekleştirmesini sağlar. Bu teknoloji, endojen transkriptleri tespit edebilen tek yöntem olmasına rağmen, hücre biyologlar canlı hücre görüntüleme için böyle problar tasarlama zorlukları nedeniyle henüz tam olarak bu teknolojiyi kucakladı değil. Yeni bir yazılım uygulaması olan pinmol, canlı hücre içindeki mRNA hedef bölgelerine verimli bir şekilde melezleşme etmek için en uygun problar gelişmiş ve hızlı tasarım sağlar. Buna ek olarak, yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı görüntü edinme ve akım, açık kaynak görüntü analiz yazılımı, mRNA ‘nın yaşam döngüsünde yer alan dinamik süreçlerin temelinin karmaşıklığının daha ince bir değerlendirilmesine yol açan, rafine edilmiş bir veri çıktısı için izin verir.
Burada tasarım ve Drosophila melanogaster yumurta odalarına moleküler işaretler teslim için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Endojen maternal mRNAs ‘ın doğrudan ve son derece spesifik tespiti ve görselleştirilmesi, iplik diski konforkop mikroskobu ile gerçekleştirilir. Görüntüleme verileri, oocayt içinde özel bölgelere taşınan ve lokalize olan mRNAs ‘ın dinamik hareketi hakkında ayrıntılı bilgi almak için ICG yazılımında nesne algılama ve izleme kullanılarak işlenir ve analiz edilir.
Introduction
Uzamsal ve temporal çözünürlüğe sahip dinamik olayları görselleştiren hücre biyolojisi çalışmaları, floresan bazlı canlı hücre görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi ile mümkün hale gelmiştir. Şu anda, In vivo mRNA görselleştirme RNA aptamer-protein etkileşimleri dayalı teknolojiler aracılığıyla elde edilir, organık boyalar RNA aptamer kaynaklı floresans ve nüklik asit prob tavlama1,2, 3. hepsi teklif yüksek özgüllük, hassasiyet ve sinyal-to-background oranı. Ancak RNA aptamer merkezli yaklaşımlar, bir transgeni protein veya organik boya bağlama için gerekli olan yapay yapısal motiflerle RNA ‘ya ifade etmek üzere tasarlanan kapsamlı genetik manipülasyon gerektirir. Örneğin, MS2/MCP sistemi, bakteriyofaj MS2 kat proteini (MCP) için bağlayıcı dizinin birden fazla tandem tekrarı içeren bir RNA yapısını ifade eden bir transgeni ve bir floresan proteini kodlayan başka bir transgeni ifade etmesini gerektirir. MCP4,5‘ e kullanılmış. Bu tür ikincil yapısal motiflerin RNA ‘ya ilavesi, hantal floresan etiketli bir proteinle birlikte, yerli RNA süreçlerinin6‘ nın etkilenmesi konusunda endişeler ortaya çıkmış olabilir. Bu endişeyi ele alan ve ek benzersiz avantajlar sunan bir teknoloji, nüklik asit bazlı yaklaşımdır, moleküler işaretler (MBs). MBS, endojen mrb ‘lerin Multiplex tespitine, tek nüklemotid varyasyonlarının ayrımcılığını ve hedef mRNA7,8ile hibridizasyon hızlı kinetiği için izin verir. MBS onlar hedeflerine melezleşme bir kez bir flororojenik Konformasyonel değişikliği geçiren önce bir sönük saç iğne kat kalır oligonükleotit problar (Şekil 1C)9. Birkaç grup, hem kodlama olmayan Rnas ‘ları (MicroRNAs ve lncrnas)10,11,12,13, RNA retrovirüsler14 ve dinamik DNA-proteini algılamak için MBS kullanmanın başarısı vardı etkileşimleri15. Onlar başarıyla çeşitli organizmalar ve dokularda, zebra balığı embriyo16, nöronlar13, tümör dokusu17, ayrım kardiyomiyosit18ve Salmonella gibi görüntüleme için istihdam edilmiştir 19 yaşında.
Burada yaşam D. melanogaster yumurta odalarında endojen mrnas için tasarım, teslimat ve algılama yaklaşımı, aktif moleküler taşıma dinamik aralığını yakalamak için yeterince hızlı bir mikroskopi set-up ile birleştiğinde açıklanmaktadır. D. melanogaster yumurta odası, erken germline kök hücre bölünmesi ve maternal gen ifadesinden bölümsel vücut planı20‘ ye kadar çok çeşitli gelişim çalışmaları için ideal bir çok hücreli model sistemi olarak hizmet vermiştir. 21 yaşında. Yumurta odaları kolayca izole edilir, büyük ve saydam, ve ex vivo analiz saatlerce dayanabilir, onları görüntüleme denemeleri için son derece kolay hale. Çok iş aktif tercüme edilmeden önce ayrık alt hücre bölgelere maternal transkriptleri asimetrik lokalizasyonu üzerinde duruldu. Özellikle, Oskar mRNA lokalizasyonu ve oocayt posterior Pole sonraki çeviri ölümcül bir bicaudal embriyo fenotipi22önlemek için sıkıca düzenlenmiş bir şekilde gerçekleşmesi gerekir. Oskar mRNA, Hemşire hücreleri denilen 15 germline hücrelerinde yazılmış ve aktif olarak sitoplazmik köprüler aracılığıyla taşınan, halka kanalları denilen, oocyte içine, Olgun yumurta olur ve sonuçta döllenen germline hücre (Şekil 1a ). Uzun menzilli hücre içi seyahat ile birlikte, Oskar mrnp ve gelen protein faktörleri dinamik işe alma ve değişimi ile ilgili zaten mevcut bilgi önemli miktarda, Oskar bir tercih aday yapmak çalışma mRNA yaşam döngüsünün birçok süreçleri. MBs mRNA lokalizasyonu süreci ile ilgili detayları açığa ve Drosophila oogenesis sırasında mRNA taşıma kontrol protein faktörlerinin düzenleme ve fonksiyon deşifre etmede enstrümantal olmuştur. Özellikle, MBS ‘yi hemşire hücrelerine mikro injeksiyon ve canlı hücre görüntüleme deneyleri yaparak, endojen mrb ‘ların takibi mümkündür8,23.
Burada sunulan yol haritası, doğal hücresel ortamında endojen mRNA ‘yı izlemek için veri analizini gerçekleştirirken, MBs kullanarak canlı bir hücre görüntüleme deneyi yaparak, görüntüleme verilerini elde ederek tam bir sürecin adımlarını sunar. Adımlar değiştirilebilir ve daha fazla kendi laboratuar ayarı içinde diğer dokular/hücre türleri ile çalışan araştırmacılar ihtiyaçlarını karşılamak için optimize edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila yumurta odalarında endojen mRNA ticaretinin canlı görselleştirme artık pinmol yazılımı ile kolayca tasarlanabilen, spesifik, verimli ve çekirdeksiz dirençli MBS kullanımına dayanır. MBs bir hedef mRNA (tercihen bölgeler ikincil yapısı ücretsiz) içinde benzersiz dizileri algılamak için tasarlanmış spesifik problar, bir transkript olası son derece çözülmüş algılama yapma. Diğer dokular/hücre türleri için bu tekniği/Protokolü benimseyen tek sınırlama, faiz nu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz, sentez, etiketleme ve moleküler işaretçileri ve arıtma için Salvatore AE Marras (kamu sağlığı Araştırma Enstitüsü Merkezi, Rutgers Üniversitesi) teşekkür ve Daniel St Johnston (Gurdon Enstitüsü, Cambridge Üniversitesi) Oskar-MS2 için/ MCP-GFP transgenik sinek stok. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı karıyer Ödülü 1149738 ve DPB profesyonel personel Kongresi-CUNY Ödülü tarafından destekleniyordu.
Materials
| Spectrofluorometer | Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon | n/a | Photon counting spectrofluorometer |
| Quartz cuvette | Fireflysci (former Precision Cells Inc.) | 701MFL | |
| Dumont #5 tweezer | World Precision Instruments | 501985 | Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Cover slip No.1 22 x 40mm | VWR | 48393-048 | |
| Dissecting microscope | Leica MZ6 Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| CO2 fruit fly anesthesia pad | Genesee Scienific | 59-114 | |
| Tris-HCL pH7.5 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Spinning disc confocal microscope | Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc. | n/a | |
| Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera | Hamamatsu | n/a | |
| PatchMan NP 2 Micromanipulator | Eppendorf Inc. | 920000037 | |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf Inc. | 920010504 | |
| Injection needle: Femtotips II | Eppendorf Inc. | 930000043 | |
| Loading tip: 20ul Microloader | Eppendorf Inc. | 930001007 | |
| Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22x40mm | VWR | 48393-026; 48393-172 | |
| Dry yeast | Any grocery store | n/a | |
| Computer, > 20 GB RAM | Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing |
Riferimenti
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
- Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5′ to 3′ degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
- Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
- Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
- Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
- Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
- Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
- Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13 (2012).
- Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626 (2014).
- Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
- Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
- Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
- Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
- Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
- Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97 (2009).
- McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
- Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241 (2009).
- Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
- Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122 (2002).
- Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
- Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
- Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
- Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2′-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69 (2008).
- Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58 (2004).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105 (2007).
- Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
- Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
- Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962 (2015).
