In Vitro Método de controle de concentrações de Gases halogenados em culturas de células epiteliais alveolares
Summary
Descreveremos um protocolo fácil projetado especificamente para atingir concentrações precisas e controladas de sevoflurano ou isoflurano em vitro a fim de melhorar a nossa compreensão dos mecanismos envolvidos na lesão pulmonar epitelial e para testar o romance terapias para a síndrome respiratória aguda.
Abstract
Síndrome da angústia respiratória (Sara) é uma síndrome de lesão alveolar difusa com afastamento fluido alveolar deficiente e inflamação grave. O uso de agentes halogenados, tais como o sevoflurano ou isoflurano, para a sedação de pacientes de unidade de terapia intensiva (UTI) pode melhorar a troca gasosa, reduzir o edema alveolar e atenuar a inflamação durante a SDRA. No entanto, dados sobre o uso de agentes inalatórios para sedação contínua na UTI para tratar ou prevenir danos nos pulmões é carente. Para estudar os efeitos dos agentes halogenados em pilhas epithelial alveolares em condições “fisiológicas”, descrevemos um sistema fácil para células de cultura na interface ar-líquido e expô-las a agentes halogenados para fornecer fracções de precisão controlada “ar” e concentrações de “médio” para esses agentes. Desenvolvemos uma câmara hermética selada em que placas com células humanas de imortalizado epiteliais alveolares podem ser expostas a uma fração precisa, controlada de sevoflurano ou isoflurano usando um fluxo de gás contínua fornecido por um circuito de máquina anestésica. As células foram expostas a 4% de sevoflurano e 1% de isoflurano durante 24 horas. Espectrometria de massa de gás foi realizada para determinar a concentração de agentes halogenados dissolvido no meio. Após a primeira hora, as concentrações de sevoflurano e isoflurano no meio foram 251 mg/L e 25 mg/L, respectivamente. As curvas que representam as concentrações de sevoflurano e isoflurano dissolvido no meio mostrou cursos semelhantes ao longo do tempo, com um patamar alcançado em uma hora após a exposição.
Este protocolo foi projetado especificamente para atingir concentrações precisas e controladas de sevoflurano ou isoflurano em vitro para melhorar a nossa compreensão dos mecanismos envolvidos na lesão pulmonar epitelial durante a SDRA e testar novas terapias para o Síndrome.
Introduction
Síndrome da angústia respiratória (Sara) é uma síndrome clínica caracterizada por lesão alveolar difusa, edema pulmonar e insuficiência respiratória hypoxemic. Embora a SDRA representa mais de 10% das admissões de unidade de terapia intensiva (UTI) e quase 25% dos pacientes de UTI que requerem ventilação mecânica, é ainda um desafio sob-reconhecido para os clínicos, com uma taxa de mortalidade do hospital de 35-45%1. Apesar de intensas pesquisas, a identificação de uma terapia farmacológica eficaz de SDRA ou prevenção falhou até à data. Dois principais recursos contribuem para a mortalidade na SDRA: prejudicada afastamento fluido alveolar (AFC) (ou seja, a reabsorção alterada do fluido de edema alveolar de espaços aéreos do pulmão distal) e inflamação grave2. Desde que a mortalidade de SDRA permanece elevada, iniciativas em curso também devem incluir a prevenção primária; no entanto, é um desafio-chave para identificar pacientes em risco, em que Sara é provável desenvolver e quem se beneficiaria se SDRA foram impedidas.
Anestésicos halogenados voláteis, tais como o sevoflurano e isoflurano, são amplamente utilizados para fornecer anestesia geral na sala de cirurgia. Em todo o mundo, mais de 230 milhões pacientes submetidos à cirurgia de grande porte cada ano exigem anestesia geral e ventilação mecânica3, e complicações pulmonares pós-operatórias afetam adversamente os resultados clínicos e saúde utilização4 . O uso do sevoflurano em vez de propofol foi associado com inflamação pulmonar melhorou em pacientes submetidos à cirurgia torácica e diminuições significativas em eventos adversos, tais como a SDRA e complicações pulmonares pós-operatórias5. Da mesma forma, o pré-tratamento com isoflurano tinha efeitos protectores na mecânica respiratória, oxigenação e hemodinâmica em modelos animais experimentais de SDRA6,7. Embora mais estudos são garantidos para abordar o impacto de agentes inalatórios em resultados na cirurgia antiagregantes, uma diminuição semelhante de complicações pulmonares tem sido observada recentemente em uma meta-análise, demonstrando que inalou agentes anestésicos — como opôs-se à anestesia intravenosa — são significativamente associados com uma redução na mortalidade para cirurgia cardíaca8.
Está faltando dados prospectivos específicos sobre o uso de agentes voláteis para a sedação de pacientes de UTI para prevenir ou tratar a lesão pulmonar. No entanto, vários ensaios agora oferecem suporte a eficácia e segurança de sevoflurano inalado para a sedação de pacientes de UTI, e estudos pré-clínicos têm demonstrado que inalatórios sevoflurano e isoflurano7,9 melhorar a troca gasosa, reduzir edema alveolar e atenua inflamação em modelos experimentais de SDRA. Além disso, sevoflurano atenua tipo II células epiteliais danos10, Considerando que o isoflurano mantém a integridade da barreira alveolar-capilar através da modulação da junção apertada proteína11. No entanto, mais estudos são necessários para verificar em que medida as evidências experimentais de proteção de órgão de inalatórios sevoflurano e isoflurano poderiam ser traduzida como seres humanos. Um primeiro single-centro controlado-randomizado (ECR) do nosso grupo encontrou que o uso precoce de sevoflurano inalado em pacientes com SDRA foi associado com oxigenação melhorada, redução dos níveis de alguns marcadores pró-inflamatórios e reduzida pulmonar epitelial danificar, avaliada pelos níveis da forma solúvel do receptor para final-produtos de glicação avançada (sRAGE) no plasma e alveolar fluido12.
Tomados em conjunto, os efeitos benéficos do sevoflurano e isoflurano na lesão pulmonar poderiam apontar para vários caminhos biológicos ou processos funcionais que dependem da via de raiva, ou seja, liberação de fluido alveolar (AFC), lesão epitelial, translocação do fator nuclear (NF)-κB e ativação de macrófagos. Além disso, sevoflurano pode influenciar a expressão da proteína raiva em si. Desde a pesquisa anterior, nossa equipe de pesquisa e outros suporta papéis pivotal para raiva na inflamação alveolar e pulmão, reparação de lesão epitelial durante a SDRA, projetamos um modelo experimental para fornecer uma compreensão translação dos mecanismos de sevoflurano em pulmão lesão e reparação13,14,15. Os efeitos em vitro de sevoflurano e isoflurano foram investigados em uma linha de romance humano alveolar primária célula epitelial especificamente projetada para estudar a barreira sangue-ar do pulmão periférico, hAELVi (humana Alveolar LentiVirus epiteliais imortalizado), com tipo alveolar-como características incluindo junções apertadas funcional16.
Enquanto preparava o design de nossas investigações em vitro (por exemplo, culturas de células epiteliais alveolares na interface ar-líquido, com a exposição “inalado” sevoflurano ou isoflurano, entendemos anteriormente publicados estudos que frações de sevoflurano só foram avaliadas no “ar” interface17,18,19 usando monitores padrão (semelhantes aos usados em um ambiente clínico). Agente halogenado concentrações geralmente foram escolhidas de acordo com os valores de concentração alveolar mínima (MAC) (por exemplo, em humanos, para sevoflurano, 0.5, 1.1 e 2.2 vol %, representando 0,25, 0,5 e 1 MAC, respectivamente; para isoflurano, 0.6, 0.8, e vol 1,3% representando 0,25, 0,5 e 1 MAC, respectivamente)20. Com efeito, concentrações de sevoflurano e isoflurano nunca foram investigadas em meio de cultura em si, limitando assim a validade de modelos/instrumentos experimentais anteriores. Além disso, a maioria dos experimentos usado um frasco anaeróbio que foi selado depois o sevoflurano contendo mistura de ar tinha sido liberado dentro. Como nosso objetivo era estudar células epiteliais alveolares em condições “fisiológicas”, acreditamos que tal um estado anaeróbico pode não ser ideal e não seria compatível com durações de tempo experimentais. Portanto, desenvolvemos nosso próprio sistema de células de cultura na interface ar-líquido e expô-las a agentes halogenados (sevoflurano e isoflurano) com o objectivo de proporcionar precisão controlada “ar” fracções e concentrações “médio” para esses agentes. Em nossa opinião, esta etapa experimental, que não foi relatada até agora na literatura, é obrigatória antes de qualquer em vitro investigações de sevoflurano e isoflurano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nosso protocolo descreve um método fácil para expor as células para uma fração precisa de um agente anestésico halogenado, tais como o sevoflurano ou isoflurano. Além disso, nós relatamos aqui — pela primeira vez — uma rigorosa correlação entre a fração do gás e da concentração de sevoflurano e isoflurano dentro do próprio meio de cultura. Este passo fundamental agora nos permite usar com segurança a nossa câmara estanque para estudar os efeitos destes agentes halogenados em uma cultura monocamadas …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o Conselho Regional de Auvergne (“programa Nouveau Chercheur de la Région Auvergne” 2013) e a francesa Agence Nationale de la Recherche e a direção Générale de L’Offre de Soins (“programa de Translationnelle de Recherche en Santé” ANR-13-PRTS-0010) para as bolsas. Os financiadores não influenciaram na concepção do estudo, conduta e análise ou na preparação deste artigo.
Materials
| Sevoflurane | Baxter | Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged | |
| Isoflurane | Virbac | Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged | |
| Human Alveolar Epithelial cells | InScreenex | INS-CI-1015 | |
| huAEC Medium (ready-to-use) | InScreenex | INS-ME-1013-500ml | |
| Anesthetic machine circuit | Drager | Fabius | |
| Gas analyzer | Drageer | Vamos Plus | |
| Anesthetic gas filter | SedanaMedical | FlurAbsord | |
| Heated Humifier | Fisher&Paykel | MR850 | |
| Chamber | Curver | 00012-416-00 | |
| Gas chromatography coupled with mass detection | Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA | Trace 1310 with TSQ 8000evo | |
| Fused-silica column (30 m x 1.4 µm, 0.25 mm ID) | Restek, Lisses, France | Rxi-624Sil MS |
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