In Vitro Metode for å kontrollere konsentrasjoner av halogenerte gasser i kulturperler Alveolar epitelceller
Summary
Vi beskriver en enkel protokoll utviklet til presis og kontrollert konsentrasjoner av desflurane eller isoflurane i vitro for å forbedre vår forståelse av mekanismer involvert i epithelial lunge skaden og teste roman behandling for akutt respiratory distress syndrom.
Abstract
Akutt respiratory distress syndrom (ARDS) er et syndrom diffus alveolar skader med nedsatt alveolar vann Demovarer og alvorlig betennelse. Bruk av halogenerte stoffer, som desflurane eller isoflurane, for sedasjon intensivavdelingen (ICU) pasienter kan forbedre gassutveksling, redusere alveolar ødem og attenuere betennelse under ARDS. Imidlertid mangler data på bruk av inhalert agenter for kontinuerlig sedasjon i ICU å behandle eller forebygge lungeskade. For å studere virkningene av halogenerte agenter på alveolar epitelceller under “fysiologiske” forhold, vi beskriver et enkelt system kultur celler i luft-flytende grensesnittet og utsette dem for halogenerte agenter å gi presise kontrollert “air” fraksjoner og “medium” konsentrasjoner for disse agentene. Vi utviklet en forseglet lufttett kammer som plater med menneskelige alveolar udødeliggjort epitelceller kan bli utsatt for en presis, kontrollert brøkdel av desflurane eller isoflurane med en kontinuerlig gasstrømmen fra en anesthetic maskin krets. Cellene ble utsatt for 4% av desflurane og 1% av isoflurane i 24 timer. Gass massespektrometri ble utført for å bestemme konsentrasjonen av halogenerte agenter oppløst i mediet. Etter først var time, konsentrasjonen av desflurane og isoflurane i medium 251 mg/L og 25 mg/L, henholdsvis. Kurvene som representerer konsentrasjonen av både desflurane og isoflurane oppløst i medium viste lignende kurs over tid, med et platå nådd på én time etter eksponering.
Denne protokollen ble spesielt utformet å nå presis og kontrollert konsentrasjoner av desflurane eller isoflurane i vitro å forbedre vår forståelse av mekanismer involvert i epithelial lungen skade under ARDS og teste romanen terapi for den syndrom.
Introduction
Akutt respiratory distress syndrom (ARDS) er et klinisk syndrom preget av diffus alveolar skade, lunge ødem og hypoxemic respirasjonssvikt. Selv ARDS representerer mer enn 10% av intensivavdelingen (ICU) innleggelser og nesten 25% av ICU pasienter som krever mekanisk ventilasjon, er det fortsatt en under-anerkjent utfordring for klinikere, med en hospital dødelighet 35-45%1. Til tross for intens forskning, har identifikasjon av en effektiv ARDS pharmacologic terapi eller forebygging ikke datoen. To større vise egenskaper bidra til dødelighet i ARDS: svekket alveolar vann Demovarer (AFC) (dvs. den endrede benresorpsjon alveolar ødem væske fra distale lunge Luftromsklassifisering) og alvorlig betennelse2. Siden ARDS dødelighet er fortsatt høy, bør gjeldende tiltak også inkludere primærforebygging; men er en viktig utfordring å identifisere i risikosonen pasienter hvem ARDS er sannsynlighet for å utvikle og som ville ha nytte hvis ARDS ble forhindret.
Flyktige halogenerte bedøvelse, som desflurane og isoflurane, brukes til å gi generell anestesi i operasjonssalen. Over hele verden, mer enn 230 millioner pasienter gjennomgå større kirurgi hvert år krever narkose og mekanisk ventilasjon3, og postoperativ lunge komplikasjoner påvirke kliniske utfall og helsetjenester utnyttelse4 . Bruk av desflurane i stedet for propofol var assosiert med bedre lungebetennelse i pasienter som gjennomgår thorax kirurgi og betydelig nedgang i uønskede hendelser, som ARDS og postoperativ lunge komplikasjoner5. Tilsvarende hadde forbehandling med isoflurane beskyttende effekt på luftveiene mekanikk og oksygenering hemodynamics i eksperimentell dyremodeller ARDS6,7. Selv om videre studier er garantert for å ta effekten av inhalert agenter på resultater i noncardiac kirurgi, en tilsvarende reduksjon i lunge komplikasjoner er observert nylig i en meta-analyse, demonstrere som inhalert bedøvende agenter, som motsetning til intravenøs anestesi, er betydelig forbundet med en nedgang i dødeligheten for kirurgi8.
Spesifikke potensielle data om bruk av flyktige agenter for beroligende ICU pasienter for å forebygge eller behandle lungeskade mangler. Imidlertid flere forsøk støtter nå effekt og sikkerhet av inhalert desflurane for beroligende ICU pasienter og prekliniske studier har vist at inhalert desflurane og isoflurane7,9 bedre gassutveksling, redusere alveolar ødem, og attenuere betennelse i eksperimentelle modeller av ARDS. I tillegg begrenser desflurane type II epithelial celle skade10, mens isoflurane opprettholder integriteten til alveolar-kapillære barrieren gjennom modulering av tett krysset protein11. Men er videre studier nødvendig å kontrollere i hvilken grad den eksperimentelle beviset på orgel beskyttelse inhalert desflurane og isoflurane kan oversettes til mennesker. En første single-senter randomisert kontrollert-studie (RCT) fra vår gruppe fant at tidlig bruk av inhalert desflurane hos pasienter med ARDS var assosiert med bedre oksygenering, reduserte nivåer av noen pro-inflammatoriske markører, og redusert lunge epithelial skade, som vurdert av nivåer av løselig form av reseptoren for avanserte glycation sluttprodukter (sRAGE) i plasma og alveolar væske12.
Sammen kunne de gunstige effektene av desflurane og isoflurane på lunge skade peke til flere biologiske banene eller funksjonelle prosesser som er avhengige av RASERI veien, nemlig alveolar vann Demovarer (AFC), epithelial skade, translokasjon av kjernefysiske faktor (NF)-κB, og macrophage aktivisering. I tillegg kan desflurane påvirke uttrykket av RASERI protein selv. Siden tidligere forskning av vår forskningsteam og andre støtter avgjørende roller for RASERI i alveolar betennelse og lunge epithelial skade/reparasjon under ARDS, utviklet vi en eksperimentell modell å gi en translational forståelse av mekanismer for desflurane i lungen skade og reparasjon13,14,15. I vitro effekten av desflurane og isoflurane ble undersøkt i en roman human alveolar epithelial primære celle linje designet spesielt luft-blod barrieren av eksterne lungene, hAELVi (menneskelige Alveolar Epithelial LentiVirus udødeliggjort), med alveolar-lignende egenskaper inkludert funksjonelle stramt veikryss16.
Klargjøring av utformingen av våre i vitro undersøkelser (f.eks kulturer av alveolar epitelceller på luft-flytende grensesnittet med eksponering for “innånding” desflurane eller isoflurane, vi forsto fra tidligere publiserte studier som deler av desflurane har bare blitt vurdert i “luften” grensesnitt17,18,19 bruker standard skjermer (ligner på de som brukes i en klinisk setting). Halogenerte agent konsentrasjoner ble vanligvis valgt i henhold til minimum alveolar konsentrasjon (MAC) verdiene (f.eks i mennesker, for desflurane, 0,5, 1.1 og 2.2 vol %, som representerer 0,25 0,5 og 1 MAC, henholdsvis; for isoflurane, 0,6, 0.8, og 1.3 vol % representerer 0,25 0,5 og 1 MAC, henholdsvis)20. Faktisk, desflurane og isoflurane konsentrasjoner har aldri vært undersøkt i kultur medium, dermed begrense gyldigheten av tidligere eksperimentelle modeller/instrumenter. Videre brukt de fleste eksperimenter en anaerob glasset som var forseglet etter luft blanding som inneholder desflurane hadde blitt tømt inne. Som målet var å studere alveolar epitelceller under “fysiologiske” forhold, trodde vi at slik en anaerob stat ikke kan optimal og ville ikke være kompatibel med lang eksperimentelle varigheter. Derfor vi utviklet vår egen kultur celler i luft-flytende grensesnittet og utsette dem for halogenerte agenter (desflurane og isoflurane) med sikte på å gi presise kontrollert “air” fraksjoner og “medium” konsentrasjoner for disse agentene. Etter vår mening er denne eksperimentelle trinnet, som ikke har blitt rapportert i litteraturen hittil, obligatorisk før noen videre i vitro undersøkelser av desflurane og isoflurane.
Protocol
Representative Results
Discussion
Våre protokollen beskriver en enkel metode for å avsløre cellene til en presis brøkdel av en halogenerte bedøvende agent, for eksempel desflurane eller isoflurane. Videre rapporterer vi her-for første gang, en streng sammenheng mellom både gass brøken og konsentrasjonen av desflurane og isoflurane innenfor kultur mediet i seg selv. Denne grunnleggende trinn kan nå oss trygt bruke våre lufttett kammer for å studere virkningene av disse halogenerte agenter i en kultivert monolayer av menneskelig alveolar epitelc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne bekrefter Auvergne Regional Council (“programmet Nouveau Chercheur de la Région Auvergne” 2013) og fransk Agence Nationale de la Recherche og retning Générale de L’Offre de Soins (“programmet de Recherche Translationnelle no Santé” ANR-13-PRTS-0010) for tilskudd. Fond ikke hadde noen innflytelse i studien design, gjennomføring og analyse eller i utarbeidelsen av denne artikkelen.
Materials
| Sevoflurane | Baxter | Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged | |
| Isoflurane | Virbac | Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged | |
| Human Alveolar Epithelial cells | InScreenex | INS-CI-1015 | |
| huAEC Medium (ready-to-use) | InScreenex | INS-ME-1013-500ml | |
| Anesthetic machine circuit | Drager | Fabius | |
| Gas analyzer | Drageer | Vamos Plus | |
| Anesthetic gas filter | SedanaMedical | FlurAbsord | |
| Heated Humifier | Fisher&Paykel | MR850 | |
| Chamber | Curver | 00012-416-00 | |
| Gas chromatography coupled with mass detection | Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA | Trace 1310 with TSQ 8000evo | |
| Fused-silica column (30 m x 1.4 µm, 0.25 mm ID) | Restek, Lisses, France | Rxi-624Sil MS |
Riferimenti
- Bellani, G., Laffey, J. G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. JAMA:T Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).
- Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. The New England Journal of Medicine. 377 (6), 562-572 (2017).
- Weiser, T. G., Regenbogen, S. E., et al. An estimation of the global volume of surgery: a modelling strategy based on available data. The Lancet. (9633), 139-144 (2008).
- Khuri, S. F., Henderson, W. G., et al. Determinants of long-term survival after major surgery and the adverse effect of postoperative complications. Annals of Surgery. 242 (3), 341-343 (2005).
- De Conno, E., Steurer, M. P., et al. Anesthetic-induced improvement of the inflammatory response to one-lung ventilation. Anesthesiology. 110 (6), 1316-1326 (2009).
- Fu, H., Sun, M., Miao, C. Effects of different concentrations of isoflurane pretreatment on respiratory mechanics, oxygenation and hemodynamics in LPS-induced acute respiratory distress syndrome model of juvenile piglets. Experimental Lung Research. 41 (8), 415-421 (2015).
- Reutershan, J., Chang, D., Hayes, J. K., Ley, K. Protective effects of isoflurane pretreatment in endotoxin-induced lung injury. Anesthesiology. (3), 511-517 (2006).
- Uhlig, C., Bluth, T., et al. Effects of Volatile Anesthetics on Mortality and Postoperative Pulmonary and Other Complications in Patients Undergoing Surgery: A Systematic Review and Meta-analysis. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 124 (6), 1230-1245 (2016).
- Li, Q. F., Zhu, Y. S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats. Anesthesia and Analgesia. (5), 1591-1597 (2009).
- Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., et al. Sevoflurane ameliorates gas exchange and attenuates lung damage in experimental lipopolysaccharide-induced lung injury. Anesthesiology. (6), 1238-1248 (2009).
- Englert, J. A., Macias, A. A., et al. Isoflurane Ameliorates Acute Lung Injury by Preserving Epithelial Tight Junction Integrity. Anesthesiology. (2), 377-388 (2015).
- Jabaudon, M., Boucher, P., et al. Sevoflurane for Sedation in ARDS: A Randomized Controlled Pilot Study. American Journal of Respiratory and Critical. , (2016).
- Blondonnet, R., Audard, J., et al. RAGE inhibition reduces acute lung injury in mice. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Receptor for Advanced Glycation End-Products Predicts Impaired Alveolar Fluid Clearance in Acute Respiratory Distress Syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 192 (2), 191-199 (2015).
- Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Forms and Ligands of the Receptor for Advanced Glycation End-Products in Patients with Acute Respiratory Distress Syndrome: An Observational Prospective Study. PloS One. 10 (8), e0135857 (2015).
- Kuehn, A., Kletting, S., et al. Human alveolar epithelial cells expressing tight junctions to model the air-blood barrier. ALTEX. 33 (3), 251-260 (2016).
- Yue, T., Roth Z’graggen, B., et al. Postconditioning with a volatile anaesthetic in alveolar epithelial cells in vitro. The European Respiratory Journal: Official Journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 31 (1), 118-125 (2008).
- Suter, D., Spahn, D. R., et al. The immunomodulatory effect of sevoflurane in endotoxin-injured alveolar epithelial cells. Anesthesia and Analgesia. (3), 638-645 (2007).
- Schläpfer, M., Leutert, A. C., Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., Booy, C., Beck-Schimmer, B. Sevoflurane reduces severity of acute lung injury possibly by impairing formation of alveolar oedema. Clinical and Experimental Immunology. (1), 125-134 (2012).
- Nickalls, R. W. D., Mapleson, W. W. Age-related iso-MAC charts for isoflurane, sevoflurane and desflurane in man. British Journal of Anaesthesia. 91 (2), 170-174 (2003).
- Bourdeaux, D., Sautou-Miranda, V., et al. Simple assay of plasma sevoflurane and its metabolite hexafluoroisopropanol by headspace GC-MS. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 878 (1), 45-50 (2010).
- Eger, E. I., Saidman, L. J., Brandstater, B. Minimum alveolar anesthetic concentration. Anesthesiology. 26 (6), 756-763 (1965).
- Perbet, S., Fernandez-Canal, C., Pereira, B., Cardot, J. M., Bazin, J. E., Constantin, J. M. Evaluation of Richmond Agitation Sedation Scale According To Alveolar Concentration of Sevoflurane During a Sedation With Sevoflurane in Icu Patients. Intensive Care Medicine Experimental. 3 (Suppl 1), (2015).
- Goolaerts, A., Pellan-Randrianarison, N., et al. Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (11), L975-L985 (2014).
