4D microscopie van gist
Summary
Dit protocol beschrijft de analyse van fluorescently gelabelde intracellulaire compartimenten in ontluikende gist met behulp van Multi-Color 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie. De beeldvormings parameters worden gekozen om adequate signalen vast te leggen en foto schade te beperken. Met aangepaste ImageJ-plug-ins kunnen gelabelde structuren worden bijgehouden en kwantitatief worden geanalyseerd.
Abstract
Het doel van dit protocol is om te karakteriseren hoe membraan compartimenten vorm en transformeren in levende cellen van ontluikende gist. Veel intracellulaire compartimenten in gist zijn dynamisch, en een volledig begrip van hun eigenschappen vereist timelapse-beeldvorming. Multi-Color 4D confocale fluorescentiemicroscopie is een krachtige methode voor het bijhouden van het gedrag en de samenstelling van een intracellulaire compartiment op een tijdschaal van 5-15 min. een grondige analyse van het compartiment dynamiek vereist de vangst van duizenden optische Secties. Om dit doel te bereiken, worden fotobleaching en fototoxiciteit geminimaliseerd door snel te scannen bij zeer lage Laser stroom, en de pixelafmetingen en Z-stap intervallen worden ingesteld op de grootste waarden die compatibel zijn met het bemonsteren van de afbeelding met volledige resolutie. De resulterende 4D-datasets zijn luidruchtig, maar kunnen worden gladgestreden door deconvolutie. Zelfs met gegevens van hoge kwaliteit is de analyse fase uitdagend omdat intracellulaire structuren vaak talrijk, heterogeen en mobiel zijn. Om aan deze behoefte te voldoen, zijn aangepaste ImageJ-plug-ins geschreven naar array 4D-gegevens op een computerscherm, identificeren van belangen structuren, bewerken van de gegevens om individuele structuren te isoleren, kwantificeren de fluorescentie tijd cursussen en maken films van de geprojecteerde Z-stacks. 4D-films zijn vooral handig voor het onderscheiden van stabiele compartimenten van tijdelijke compartimenten die omkomen door rijping. Dergelijke films kunnen ook worden gebruikt om gebeurtenissen zoals compartiment fusie te karakteriseren en om de effecten van specifieke mutaties of andere verstoringen te testen.
Introduction
Compartimenten van het endomembraansysteem-systeem zijn in constante flux en hun volledige karakterisering vereist Live-celbeeldvorming. Hier beschreven is een protocol dat 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie gebruikt om fluorescently gelabelde compartimenten te visualiseren in ontluikende gisten. De methode werd ontwikkeld om de dynamiek van secretoire compartimenten in Pichia pastoris en Saccharomyces cerevisiae1,2,3te volgen. Dit protocol richt zich op S. cerevisiae, die een niet-gestapelde Golgi heeft waarin de individuele cisternae optisch resolveerbaar4zijn. De ongewone Golgi-organisatie in S. cerevisiae heeft de demonstratie van 4D microscopie mogelijk gemaakt dat een Golgi Cisterna aanvankelijk etiketten met Resident vroege Golgi-eiwitten, en vervolgens deze eiwitten verliest tijdens het verwerven van Resident late Golgi-eiwitten3 ,5. Deze overgang kan worden gevisualiseerd door het creëren van een stam waarin de vroege Golgi eiwit Vrg4 is gelabeld met GFP terwijl de late Golgi eiwit Sec7 is gelabeld met een monomere rode fluorescerende eiwitten. Wanneer individuele cisternae worden bijgehouden, rijping wordt waargenomen als een groen-naar-rood conversie3. Dit type analyse kan waardevolle informatie geven over de eiwit lokalisatie en de identiteit van het compartiment. Bijvoorbeeld, twee eiwitten met licht offset aankomst-en vertrektijden kunnen soms lijken om verschillende compartimenten te labelen in statische beelden, maar kunnen worden gezien in 4D-films om hetzelfde compartiment op verschillende tijdstippen te labelen6,7 . Zo onthult 4D microscopie verschijnselen die anders niet duidelijk zouden zijn.
Informatieve 4D microscopie van gist compartimenten kan worden bereikt met de juiste procedures en apparatuur2. Waar mogelijk wordt fluorescerende eiwit tagging uitgevoerd door Gene Replacement8 om overexpressie artefacten te voorkomen. Omdat intracellulaire structuren vaak zeer dynamisch zijn, is 4D-beeldvorming nodig om ervoor te zorgen dat een structuur na verloop van tijd betrouwbaar wordt bijgehouden. Het protocol hier beschreven maakt gebruik van een laser scanning confocale Microscoop uitgerust met hoge gevoeligheid detectoren. Met dit apparaat kan het volledige celvolume van S. cerevisiae worden afgebeeld met een confocale microscopie ongeveer elke 1-3 s, waarbij 2 S-intervallen kenmerkend zijn. Gegevens kunnen worden verzameld voor maximaal 5-15 min afhankelijk van de dichtheid van de fluoroforen en hun fotomophysical eigenschappen labelen. De belangrijkste hindernis is het minimaliseren van photobleaching. Voor dit doel worden de laser intensiteiten zo laag mogelijk gehouden, de confocale scansnelheid is gemaximaliseerd, en de optische parameters zijn geconfigureerd voorbeeld bij de Nyquist-limiet om de relevante informatie te vangen terwijl overmatige licht blootstelling wordt vermeden. Deze instellingen worden ook verwacht om de fototoxiciteit te verlichten, een factor die vaak over het hoofd wordt gezien tijdens Live-celbeeldvorming9,10,11. De resulterende lawaaierige gegevens worden verwerkt met bleekmiddel correctie en deconvolutie algoritmen om kwantificering van fluorescentie intensiteiten te vergemakkelijken.
Zelfs met 4D-films van hoge kwaliteit is de analyse lastig omdat gist compartimenten vaak talrijk, heterogeen en mobiel zijn. Vanwege de intrinsieke beperkingen van confocale microscopie en de niet-optimale instellingen die nodig zijn voor langdurige 4D-beeldvorming, zijn fluorescerende structuren die in de buurt van elkaar liggen moeilijk op te lossen. Dit probleem kan worden omzeild door zich te concentreren op het kleine aantal fluorescerende constructies dat voor de duur van de etiketterings periode optisch afwikkelbaar blijft, met de veronderstelling dat deze structuren representatief zijn voor de hele populatie van gelabelde Compartimenten. Fluorescerende compartimenten die betrouwbaar kunnen worden bijgehouden, worden geïdentificeerd door films van geprojecteerde Z-stacks te bekijken en door een reeks montages te maken waarin de optische secties voor elk tijdpunt op een computerscherm worden weergegeven. Deze analyse maakt gebruik van aangepaste ImageJ12 plugins, die het mogelijk maken een individuele structuur in afzondering worden bijgehouden.
Recente methodes papers bestreken het gebruik van fluorescerende eiwitten in gist13 , evenals de theorie en praktijk van 4D confocale beeldvorming van gistcellen2. Dit protocol richt zich op de belangrijkste praktische aspecten van een 4D Imaging experiment. Het bevat enkele verbeteringen aan eerder beschreven procedures, evenals bijgewerkte versies van de ImageJ-invoegtoepassing code en documentatie. Het getoonde voorbeeld richt zich op Golgi-dynamiek, maar dit protocol is ook geschikt voor de beeldvorming van andere gist compartimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
4D confocale beeldvorming van gist organellen vereist zorgvuldige afstemming van meerdere parameters. De belangrijkste zorg is fotobleaching en fototoxiciteit. Een typische 4D-film omvat het verzamelen van duizenden optische secties, zodat de laser verlichting zo laag mogelijk moet worden gehouden. Tandem fluorescerende eiwit Tags kunnen worden gebruikt om het signaal te stimuleren zonder de expressie van het gelabelde eiwit16,17te verhogen. Het maximaliseren van…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH Grant R01 GM104010. Bedankt voor de hulp met fluorescentiemicroscopie aan Vytas Bindokas en Christine labno op de geïntegreerde microscopie kern faciliteit, die wordt ondersteund door de door NIH gefinancierde Cancer Center ondersteuning Grant P30 CA014599.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
References
- Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris. Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).
- Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. 4D confocal imaging of yeast organelles. Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).
- Losev, E., et al. Golgi maturation visualized in living yeast. Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).
- Papanikou, E., Glick, B. S. The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries. FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).
- Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation. Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).
- Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
- Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. COPI selectively drives maturation of the early Golgi. eLife. 4, 13232 (2015).
- Rothstein, R. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast. Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).
- Carlton, P. M., et al. Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. A review of fluorescent proteins for use in yeast. Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).
- Day, K. J., et al. Improved deconvolution of very weak confocal signals. F1000Research. 6, 787 (2017).
- Bhave, M., et al. Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation. Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).
- Rossanese, O. W., et al. A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).
- Connerly, P. L., et al. Sec16 is a determinant of transitional ER organization. Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).
- Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins. BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).
- Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).
- Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics. Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).
- Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
- Casler, J. C., et al. Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi. Journal of Cell Biology. , (2019).
