4D microscopia de levedura

Summary

Este protocolo descreve a análise de compartimentos intracelular cDNAs etiquetados no fermento de brotamento usando a microscopia confocal 4D (Time-Lapse 3D) multi-color. Os parâmetros de imagem são escolhidos para capturar sinais adequados, limitando o Fotodano. Os plugins personalizados do ImageJ permitem que as estruturas rotuladas sejam rastreadas e analisadas quantitativamente.

Abstract

O objetivo deste protocolo é caracterizar como os compartimentos da membrana se formam e se transformam em células ao vivo de levedura brotamento. Muitos compartimentos intracelular no fermento são dinâmicos, e uma compreensão cheia de suas propriedades exige a imagem latente do tempo-lapso. A microscopia de fluorescência confocal 4D multi-color é um método poderoso para controlar o comportamento e a composição de um compartimento intracelular em uma escala de tempo de 5-15 minutos. a análise rigorosa da dinâmica do compartimento requer a captura de milhares de Seções. Para atingir esse objetivo, o fotobranqueamento e a fototoxicidade são minimizados através da digitalização rápida a uma potência de laser muito baixa, e as dimensões de pixel e os intervalos Z-Step são definidos para os maiores valores que são compatíveis com a amostragem da imagem em resolução total. Os conjuntos de dados 4D resultantes são ruidosos, mas podem ser suavizados pela desvolução. Mesmo com dados de alta qualidade, a fase de análise é desafiadora porque as estruturas intracelulares são muitas vezes numerosas, heterogêneas e móveis. Para atender a essa necessidade, os plugins personalizados do ImageJ foram gravados em dados de matriz 4D em uma tela de computador, identificam estruturas de interesse, editam os dados para isolar estruturas individuais, quantificam os cursos de tempo de fluorescência e fazem filmes das pilhas Z projetadas. os filmes 4D são particularmente úteis para distinguir compartimentos estáveis de compartimentos transitórios que se transformam por maturação. Esses filmes também podem ser usados para caracterizar eventos como a fusão do compartimento, e para testar os efeitos de mutações específicas ou outras perturbações.

Introduction

Os compartimentos do sistema do endomembranas estão no fluxo constante, e sua caracterização cheia exige a imagem latente viva da pilha. É descrito aqui um protocolo que emprega a microscopia confocal de 4D (lapso de tempo 3D) para visualizar compartimentos cDNAs etiquetados em leveduras de brotamento. O método foi desenvolvido para rastrear a dinâmica dos compartimentos secretores em Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae^1,2,3. Este protocolo centra-se sobre S. Centrume, que tem um Golgi nonempilhados em que os cisternae individuais são opticamente resolvíveis⁴. A organização incomun de Golgi em S. cerevisiae permitiu a demonstração pela microscopia 4D que um cisterna de Golgi etiqueta inicialmente com as proteínas adiantadas do Golgi do residente, e perde então aquelas proteínas ao adquirir proteínas atrasadas residentes do Golgi^{3 ,5}. Esta transição pode ser visualizada através da criação de uma cepa em que o início da proteína Golgi Vrg4 é rotulado com GFP, enquanto o final da proteína Golgi Sec7 é rotulado com uma proteína monomérica vermelha fluorescente. Quando as cisternas individuais são controladas, a maturação é observada como uma conversão verde-a-vermelha³. Este tipo de análise pode fornecer informações valiosas sobre a localização de proteínas e a identidade do compartimento. Por exemplo, duas proteínas com tempos de chegada e partida ligeiramente compensados podem, às vezes, aparecer para rotular diferentes compartimentos em imagens estáticas, mas podem ser vistos em filmes 4D para rotular o mesmo compartimento em diferentes pontos de tempo^6,7 . Assim, a microscopia 4D revela fenômenos que, de outra forma, não seriam evidentes.

A microscopia 4D informativa de compartimentos do fermento pode ser conseguida com procedimentos e equipamento apropriados². Sempre que possível, a marcação de proteínas fluorescentes é realizada pela substituição do gene⁸ para evitar artefatos de superexpressão. Porque as estruturas intracelular são frequentemente muito dinâmicas, a imagem latente 4D é precisada assegurar-se de que uma estrutura esteja controlada confiantemente sobre o tempo. O protocolo descrito aqui emprega um microscópio confocal da exploração do laser equipado com os detectores elevados da sensibilidade. Com este dispositivo, o volume inteiro da pilha de s. cerevisiae pode ser imaged pela microscopia confocal aproximadamente cada 1-3 s, com os intervalos de 2 s que são típicos. Os dados podem ser coletados por até 5-15 min, dependendo das densidades de rotulagem dos fluoróforos e suas propriedades fotofísicas. O obstáculo principal é minimizar o fotobranqueamento. Para esta finalidade, as intensidades do laser são mantidas tão baixas como possível, a velocidade Confocal da varredura são maximizadas, e os parâmetros óticos são configurados à imagem no limite de Nyquist a fim capturar a informação relevante ao evitar a exposição clara excessiva. Essas configurações também são esperadas para aliviar a fototoxicidade, um fator que muitas vezes é negligenciado durante a imagem de célula viva^9,10,11. Os dados ruidosos resultantes são processados com correção de lixívia e algoritmos de desvolução para facilitar a quantificação das intensidades de fluorescência.

Mesmo com filmes 4D de alta qualidade, a análise é complicada porque os compartimentos de levedura tendem a ser numerosos, heterogêneos e móveis. Devido às limitações intrínsecas da microscopia confocal e dos ajustes não-óptimos exigidos para a imagem latente 4D prolongada, as estruturas fluorescentes que são perto de se são duras de resolver. Este problema pode ser contornado centrando-se no pequeno número de estruturas fluorescentes que permanecem opticamente resolvíveis durante o período de rotulagem, com a suposição de que essas estruturas são representativas de toda a população de rotulados Compartimentos. Os compartimentos fluorescentes que podem ser controlados confiantemente são identificados visualizando filmes de pilhas Z projetadas e criando uma série de montagens em que as seções óticas para cada ponto de tempo são vestiu em uma tela de computador. Essa análise emprega plugins personalizados do ImageJ¹² , que permitem que uma estrutura individual seja rastreada isoladamente.

Os trabalhos recentes dos métodos cobriram o uso de proteínas fluorescentes no fermento¹³ assim como a teoria e a prática da imagem latente confocal 4D de pilhas de fermento². Este protocolo centra-se sobre os principais aspectos práticos de um experimento de imagem 4D. Ele inclui alguns aprimoramentos para procedimentos descritos anteriormente, bem como versões atualizadas do código e da documentação do plug-in do ImageJ. O exemplo mostrado centra-se sobre a dinâmica de Golgi, mas este protocolo é ingualmente apropriado para imagens outros compartimentos do fermento.

Protocol

1. preparação Faça o meio NSD mínimo não fluorescente2. Espera-se que a ausência de riboflavina reduza a fluorescência verde intracelular de fundo e a fototoxicidade associada. Cresça a tensão da levedura durante a noite em ~ 23 ° c à fase logarítmica em 5 mL de NSD em um balão perplexo de 50 mL com boa aeração. Aproximadamente 3-4 h antes da análise, diluir a cultura do fermento em NSD fresco de modo que o OD final600 seja 0.5-0.8 na altura da imagem latente.</li…

Representative Results

O exemplo dado aqui documenta e quantifica a maturação de duas cisternas de Golgi do fermento como visualizadas pela microscopia confocal 4D da duplo-cor3. Uma célula de levedura contém na ordem de 10-15 Golgi cisternae, cada um dos quais amadurece ao longo de um curso de tempo de aproximadamente 2-4 min. a maturação pode ser visualizada através da marcação do marcador Golgi precoce Vrg4 com GFP e marcando o marcador final do Golgi Sec7 com um fluorescente…

Discussion

a imagem latente de 4D confocal de organelas do fermento exige o ajuste cuidadoso de parâmetros múltiplos. A maior preocupação é o fotobranqueamento e a fototoxicidade. Um típico filme 4D envolve a coleta de milhares de seções ópticas, de modo que a iluminação do laser deve ser mantido o mais baixo possível. As etiquetas fluorescentes em tandem da proteína podem ser usadas para impulsionar o sinal sem aumentar a expressão da proteína etiquetada^{16,17</sup…}

Materials

35 mm glass bottom dishes No. 1.5	MatTek	P35G-0.170-14-C	Imaging dishes
Concanavalin A powder	Sigma-Aldrich	C2010
Trolox	Vector Laboratories	CB-1000
Leica SP8 confocal microscope	Leica Microsystems
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Microscope software
Huygens Essential software, version 17.04	Scientific Volume Imaging		Deconvolution software
ImageJ	NIH		Image processing and analysis software