Microscopia 4D del lievito
Summary
Questo protocollo descrive l’analisi dei compartimenti intracellulari etichettati fluorescentmente in lievito in erba utilizzando la microscopia confocale 4D (time-lapse 3D). I parametri di imaging vengono scelti per catturare segnali adeguati limitando i fotodanni. I plug-in Custom ImageJ consentono di tenere traccia delle strutture etichettate e di analizzarle quantitativamente.
Abstract
L’obiettivo di questo protocollo è quello di caratterizzare come i compartimenti della membrana si formano e si trasformano in cellule vive di lievito in erba. Molti compartimenti intracellulari nel lievito sono dinamici e una piena comprensione delle loro proprietà richiede l’imaging time-lapse. La microscopia a fluorescenza confocale 4D multicolore 4D è un metodo potente per monitorare il comportamento e la composizione di un compartimento intracellulare su una scala temporale di 5-15 min. L’analisi rigorosa della dinamica del compartimento richiede la cattura di migliaia di Sezioni. Per raggiungere questo obiettivo, il fotosbiancamento e la fototossicità vengono ridotti al minimo mediante la scansione rapida a bassissima potenza laser, e le dimensioni dei pixel e gli intervalli di passo z vengono impostati sui valori più grandi compatibili con il campionamento dell’immagine a piena risoluzione. I set di dati 4D risultanti sono rumorosi, ma possono essere levigati dalla deconvoluzione. Anche con dati di alta qualità, la fase di analisi è impegnativa perché le strutture intracellulari sono spesso numerose, eterogenee e mobili. Per soddisfare questa esigenza, i plugin ImageJ personalizzati sono stati scritti per mettere in rete dati 4D sullo schermo di un computer, identificare le strutture di interesse, modificare i dati per isolare le singole strutture, quantificare i corsi temporali di fluorescenza e fare filmati degli stack di z proiettati. I film 4D sono particolarmente utili per distinguere i compartimenti stabili dai compartimenti transitori che girano per maturazione. Tali filmati possono anche essere utilizzati per caratterizzare eventi come la fusione dei compartimenti e per testare gli effetti di mutazioni specifiche o altre perturbazioni.
Introduction
I compartimenti del sistema di endomembrana sono in costante flusso, e la loro caratterizzazione completa richiede l’imaging delle cellule vive. Descritto qui è un protocollo che impiega la microscopia confocale 4D (time-lapse 3D) per visualizzare scomparti etichettati fluorescentmente in lieviti in erba. Il metodo è stato sviluppato per monitorare la dinamica dei compartimenti secretorici in Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Questo protocollo si concentra su S. cerevisiae, che ha un Golgi non impilato in cui le singole cisterne sono otticamente risolvibili4. L’insolita organizzazione Golgi a S. cerevisiae ha permesso la dimostrazione di microscopia 4D che una cisterna Golgi inizialmente etichetta con proteine Golgi precoci residenti, e poi perde quelle proteine mentre acquisisce proteine residenti tardo Golgi3 ,5. Questa transizione può essere visualizzata creando un ceppo in cui la proteina Predicità Golgi Vrg4 è etichettata con GFP mentre la proteina Sec7 tardo Golgi è etichettata con una proteina fluorescente rossa monomerica. Quando le singole cisterne vengono tracciate, la maturazione viene osservata come conversione da verde a rosso3. Questo tipo di analisi può fornire informazioni preziose sulla localizzazione delle proteine e sull’identità del compartimento. Ad esempio, due proteine con orari di arrivo e partenza leggermente sfalsati potrebbero talvolta sembrare etichettare scomparti diversi in immagini statiche, ma possono essere viste nei film 4D per etichettare lo stesso vano in punti temporali diversi6,7 . Così, la microscopia 4D rivela fenomeni che altrimenti non sarebbero evidenti.
La microscopia 4D informativa dei compartimenti lievito può essere ottenuta con procedure e attrezzature appropriate2. Quando possibile, l’etichettatura delle proteine fluorescenti viene eseguita mediante la sostituzione genica8 per evitare artefatti di sovraespressione. Poiché le strutture intracellulari sono spesso molto dinamiche, l’imaging 4D è necessario per garantire che una struttura venga tracciata in modo affidabile nel tempo. Il protocollo qui descritto utilizza un microscopio confocale a scansione laser dotato di rilevatori ad alta sensibilità. Con questo dispositivo, l’intero volume cellulare di S. cerevisiae può essere immaginato mediante microscopia confocale circa ogni 1-3 s, con intervalli di 2 s tipici. I dati possono essere raccolti fino a 5-15 min a seconda delle densità di etichettatura dei fluorofori e delle loro proprietà fotofisiche. L’ostacolo principale è quello di ridurre al minimo il fotosbiancamento. A tale scopo, le intensità laser vengono mantenute il più basse possibile, la velocità di scansione confocale viene massimizzata e i parametri ottici sono configurati per l’immagine al limite di Nyquist al fine di catturare le informazioni pertinenti evitando un’eccessiva esposizione alla luce. Queste impostazioni sono anche tenuti ad alleviare la fototossicità, un fattore che viene spesso trascurato durante l’imaging delle cellule vive9,10,11. I dati rumorosi risultanti vengono elaborati con la correzione della candeggina e algoritmi di deconvoluzione per facilitare la quantificazione delle intensità di fluorescenza.
Anche con film 4D di alta qualità, l’analisi è difficile perché i compartimenti di lievito tendono ad essere numerosi, eterogenei e mobili. A causa delle limitazioni intrinseche della microscopia confocale e delle impostazioni non ottimali necessarie per l’imaging 4D prolungato, le strutture fluorescenti che sono vicine tra loro sono difficili da risolvere. Questo problema può essere risolto concentrandosi sul piccolo numero di strutture fluorescenti che rimangono otticamente risolvibili per tutta la durata del periodo di etichettatura, partendo dal presupposto che tali strutture siano rappresentative dell’intera popolazione di persone etichettate Scomparti. I compartimenti fluorescenti che possono essere tracciati in modo affidabile sono identificati visualizzando filmati di stack di z proiettati e creando una serie di montaggi in cui le sezioni ottiche per ogni punto temporale sono schierate sullo schermo di un computer. Questa analisi impiega plugin personalizzati ImageJ12, che permettono di tracciare una struttura individuale in isolamento.
Recenti studi di metodi riguardavano l’uso di proteine fluorescenti nel lievito13, nonché la teoria e la pratica dell’imaging confocale 4D delle cellule di lievito2. Questo protocollo si concentra sugli aspetti pratici chiave di un esperimento di imaging 4D. Include alcuni miglioramenti alle procedure descritte in precedenza, nonché le versioni aggiornate del codice e della documentazione del plug-in ImageJ. L’esempio mostrato si concentra sulla dinamica di Golgi, ma questo protocollo è ugualmente adatto per l’imaging di altri compartimenti di lievito.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’imaging confocale 4D degli organelli di lievito richiede un’attenta messa a punto di più parametri. La preoccupazione principale è il fotosbiancamento e la fototossicità. Un tipico filmato 4D prevede la raccolta di migliaia di sezioni ottiche, quindi l’illuminazione laser deve essere mantenuta il più bassa possibile. I tag proteici fluorescenti Tandem possono essere utilizzati per aumentare il segnale senza aumentare l’espressione della proteina marcata16,17</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH R01 GM104010. Grazie per l’assistenza con la microscopia a fluorescenza a Vytas Bindokas e Christine Labno presso l’Integrated Microscopy Core Facility, supportato dal Cancer Center Support Grant P30 CA30 CA30 CA30 CA30 CA30 CA30.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
References
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