蛍光光度法による精子膜評価技術
Summary
精子膜の完全性、精子の受精能力に関連付けられている携帯電話の機能を評価する方法論を紹介します。精子の膜の蛍光光度法による評価のための 3 つの技術について述べる: 高度な精子専用フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、特定の蛍光プローブの同時染色します。方法論を組み合わせることの紹介も。
Abstract
精子の質を記述する標準的な spermiograms 主、射精量、濃度、運動と進歩的な運動と精子形態の生存率など、生理学的および視覚的パラメーターに基づいています。しかし、これらの評価なしは精液の品質を予測するのに十分です。精子の生存率及び受精可能性の維持は、膜の完全性および細胞内の機能に依存することを考えるこれらのパラメーターの評価は、精子受精能力のより良い予測を可能にするかもしれない。ここでは、蛍光顕微鏡やフローのフローサイトメトリー解析と組み合わせて特定の蛍光プローブを用いた精子の質を評価する 3 つの可能な方法をについて説明します。解析評価 4′, 6-diamidino-2-phenylindole を使用して細胞膜の整合性 (DAPI) とヨウ化 propidium (PI)、イソチオ シアン酸共役フルオレスセインを使用して整合性を先膜エンドウ凝集素 (FITC PSA) と5, 5′, を使用してミトコンドリア膜の完全性 6、6′-テトラ-クロロ-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine ヨウ化 (JC-1)。また、これらの方法の組み合わせを提示します。例えば、アネキシン V の使用は PI 蛍光色素によりアポトーシスを評価およびアポトーシス精子 (アポトーシス インデックス) の割合を計算すると組み合わせます。精子膜の検討に基づいて、これらの方法論は精子の質を評価するために非常に有用と考えます。
Introduction
整合性と精子の膜の機能は、精子の生存率と潜在的な受精を示す要因の一部です。細胞膜は、細胞浸透圧平衡1維持、細胞内と細胞外のコンパートメント間の障壁として機能します。プラズマ膜の完全性への損傷を誘発するストレスが恒常性を損なう、生存率及び受精能力削減および細胞死を増やします。例えば、凍結保存は温度変化と浸透圧ストレス2の結果としてその原形質膜への損傷をによる精子の生存率を低減します。我々 は以前報告公開農薬アトラジン、その主要代謝物 diaminochlorotriazine カビ毒アフラトキシン B1 など食品由来汚染物質の低濃度に雄牛の精液精子生存率1,3 を減少させること.これは、破損した細胞膜と細胞の DNA に結合する PI との組み合わせで DAPI で二本鎖 DNA を標識によって決定されました。
精子先体反応 (AR) は、外側の精子膜と先酵素4、5の解放に終って覆う膜の融合を含まれます。これらは、透明帯の浸透とさらに6卵と精子の結合の重要なイベントです。したがって、先膜の完全性の評価は、精液性状と男性の生殖能力7,8,9評価に有用なパラメーターを構成します。いくつかの蛍光灯のテクニックは、精子の整合性、FITC PNA または FITC PSA8,10の検証に適しています。FITC PSA 染色1,3パターンを使用して私たちの以前の研究で、(i) の正確な定義をそのまま精子提供、(ii) 精子膜を破損しているし、(iii) 精子先体反応します。現在のレポートでは、精子専用フローサイトメトリーを使用して精子の状態を評価し、蛍光顕微鏡を使用して、結果を比較します。
ミトコンドリアは、多機能の細胞小器官で、他のもの、ATP 合成、活性酸素種の生産、カルシウム シグナル伝達とアポトーシスの関与です。生理学的な機能不全、男性と女性の不妊を含む変更されたミトコンドリア機能11に関連付けられます。精子のミトコンドリアは、midpiece に配置され、精子運動12で重要な役割を果たします。高のミトコンドリア膜電位 (ΔΨm) は通常の運動性と高い受精能力13に関連付けられてそれをよく受け入れられています。対照的に、低 ΔΨm は活性酸素種の高いレベルに関連付けられてし、受精率14を削減します。それにもかかわらず、様々 な環境物質、例えば内分泌かく乱物質を細胞ストレスを誘発でき、ΔΨm、過分極1,3フリーラジカルと最終的には、生産の増加の一時的な増加につながるアポトーシス15。蛍光プローブ 5, 5′, 6, 6′-テトラ-クロロ-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine ヨウ化 (JC-1) により、たとえば、精子 ΔΨm1,3食中毒の毒素の影響を調べること。
生理学的および形態学的パラメーターに基づく標準の spermiograms は精液の品質を予測するのに十分ではありません。正確な方法は、精子の質を確保するため必要があります。ここで、精子の膜の評価に基づく精子の質を決定する 2 つの可能な方法を提供: 特定の蛍光プローブと蛍光顕微鏡、私たち研究1,3に記載されている同時 4 人染色最近既に他のユーザーによって使用されている当研究室において利用される高度な精子専用フローサイトメトリー、16,17,18。
Protocol
Representative Results
Discussion
精子の受精の可能性は、その品質を反映した複数の要因に依存します。精子の高濃度と徐々 に高運動性の精子の割合が高い高品質の精液を考慮可能性があります。それにもかかわらず、このような評価、アカウントにとらない他の携帯電話と機能パラメーター。’卓上’ マイクロキャピ ラリー流れの cytometer の使用はで先ほど他17本 (法 #3) 蛍光プローブを用いた様々 なの精?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、彼らの助けと協力、計測器のセットアップとトレーニングの支援の李娜 (IMV 技術、l ‘ aigle、フランス) さんの「シオン」人工授精と繁殖 (Hafetz、イスラエル共和国) のためのイスラエルの会社を感謝したいです。
Materials
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20X stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
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