Fluorimétrica de técnicas para la evaluación de las membranas del esperma
Summary
Aquí, presentamos a metodologías para evaluar la integridad de la membrana de spermatozoan, una característica celular asociada con la capacidad de fertilización del esperma. Se describen tres técnicas para la evaluación de fluorimétrico de las membranas del esperma: coloración simultánea con sondas fluorescentes específicas, microscopía de fluorescencia y citometría de flujo avanzada dedicado de esperma. También se presentan ejemplos de la combinación de las metodologías.
Abstract
Espermogramas estándar que describe la calidad del esperma se basan principalmente en los parámetros fisiológicos y visuales, como el volumen de eyaculado y concentración, motilidad y motilidad progresiva, morfología espermática y viabilidad. Sin embargo, ninguna de estas evaluaciones es suficiente predecir la calidad del semen. Dado que el mantenimiento de viabilidad espermática y la fertilización potencial depende de la integridad de la membrana y función intracelular, evaluación de estos parámetros puede permitir una mejor predicción de la capacidad de fertilización del esperma. Aquí, Describimos tres métodos posibles para evaluar la calidad del esperma mediante sondas fluorescentes específicas combinadas con análisis de citometría de flujo o microscopia de fluorescencia. Análisis evaluaron la integridad de la membrana plasmática con 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y yoduro de propidio (PI), integridad de la membrana acrosómica usando conjugados con isotiocianato de fluoresceína aglutinina de Pisum sativum (PSA-FITC) y integridad de la membrana mitocondrial con 5, 5′, 6, 6′-tetra-cloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine yoduro (JC-1). También se presentan combinaciones de estos métodos. Por ejemplo, el uso de anexina V combinado con PI fluorocromos permite evaluar apoptosis calcular la proporción de espermatozoides apoptóticos (índice de apoptosis). Creemos que estas metodologías, que se basan en el examen de las membranas del espermatozoide, son muy útiles para la evaluación de la calidad del esperma.
Introduction
Integridad y funcionalidad de las membranas del esperma son algunos de los factores que indica viabilidad espermática y la fertilización posible. La membrana plasmática actúa como una barrera entre los compartimientos intracelulares y extracelulares, manteniendo así el equilibrio osmótico celular1. Cualquier estrés que induce daño en la integridad de la membrana plasmática pueden la homeostasis, reducen la capacidad de viabilidad y fertilización e incrementar la muerte celular. Por ejemplo, criopreservación reduce la viabilidad espermática debido al daño a la membrana plasmática, como resultado de los cambios de temperatura y estrés osmótico2. Hemos divulgado previamente que exponer los espermatozoides de Toro para bajas concentraciones de contaminantes de los alimentos tales como la plaguicidas atrazina, su metabolito principal diaminochlorotriazine o la aflatoxina de micotoxina B1, reduce el esperma viabilidad1,3 . Esto fue determinado por el ADN de doble hebra con DAPI de etiquetado en combinación con PI, que se une al ADN de las células con una membrana de plasma dañada.
Reacción acrosómica (RA) consiste en la fusión de la membrana acrosómica externa y la membrana plasmática suprayacente resultando en la liberación de enzimas acrosómica4,5. Estos son eventos esenciales para la penetración de la zona pelúcida y fusión del espermatozoide con el ovocito6más. Por lo tanto, la evaluación de la integridad de la membrana acrosómica constituye un parámetro útil para evaluar la calidad del semen y la fertilidad masculina7,8,9. Varias técnicas fluorescentes son convenientes para la verificación de integridad del acrosoma, FITC-PNA o FITC-PSA8,10. En nuestros estudios anteriores, utilizando los patrones de FITC-PSA tinción1,3, proporciona las definiciones precisas para (i) acrosoma intacto, (ii) dañar la membrana del acrosoma y (iii) reacción acrosómica. En el informe actual, evaluar el estado del acrosoma mediante citometría de flujo de esperma dedicado y comparar los resultados a aquellos que utilizan la microscopía de fluorescencia.
Las mitocondrias son organelos multifuncionales involucrada en, entre otras cosas, ATP síntesis, producción de especies reactivas del oxígeno, señales de calcio y apoptosis. Disfunciones fisiológicas, incluyendo la infertilidad masculina y femenina, se asocian con alteración de la función mitocondrial11. Las mitocondrias del espermatozoide se arreglan en la midpiece y desempeñan un papel crucial en el esperma motilidad12. Es bien aceptado que el alto potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) se asocia con motilidad normal y fertilización alta capacidad13. En cambio, ΔΨm bajo se asocia con un nivel elevado de especies reactivas de oxígeno y reducción de la tasa de fertilización14. Sin embargo, varios compuestos ambientales, por ejemplo los disruptores endocrinos, pueden inducir estrés celular y conducir a un aumento transitorio en hiperpolarización1,3, ΔΨm, aumento de la producción de radicales libres y eventualmente, 15de la apoptosis. La sonda fluorescente 5, 5′, 6, 6′-tetra-cloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine yoduro (JC-1) permite examinar por ejemplo, los efectos de las toxinas transmitidas por los alimentos en esperma ΔΨm1,3.
Espermogramas estándar, basadas en parámetros morfológicos y fisiológicos, no son lo suficientemente buenas como predecir la calidad del semen. Se requieren métodos más precisos para asegurar la calidad del esperma. Presentamos dos métodos posibles para determinar la calidad del esperma basada en evaluaciones de las membranas del esperma: coloración cuádruple simultánea con sondas fluorescentes específicas y microscopía de fluorescencia, descrito en nuestros estudios1,3 y citometría de flujo de esperma dedicado avanzado recientemente en nuestro laboratorio y ya siendo utilizado por otros16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Potencial de fecundación de espermatozoides depende de múltiples factores que refleja su calidad. Una alta concentración de espermatozoides y una alta proporción de espermatozoides móviles altamente progresivamente podrían considerarse semen de alta calidad. Sin embargo, esa evaluación no toma en cuenta otros parámetros celulares y funcionales. El uso de la ‘bancada’ microcapillary citometría de flujo puede ser fácilmente adaptado a la evaluación de diferentes estructuras de esperma mediante sondas fluorescent…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a compañía israelí “SION” para la inseminación artificial y cría (Hafetz Haim, Israel) por su ayuda y cooperación y la Sra. Li Na (IMV Technologies, L’Aigle, Francia) para obtener ayuda con la configuración del instrumento y entrenamiento.
Materials
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20X stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
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