Fluorimetriskt tekniker för bedömning av spermier membran
Summary
Här presenterar vi metoder för att utvärdera spermatozoan membran integritet, en cellulär funktion som är associerad med spermier befruktning kompetens. Vi beskriver tre tekniker för fluorimetriskt bedömning av spermier membran: samtidiga färgning med specifika fluorescerande sonder, fluorescensmikroskopi och avancerade spermier-dedikerad flödescytometri. Exempel att kombinera metoderna presenteras också.
Abstract
Standard spermiograms som beskriver spermiekvalitet är mestadels baserade på fysiologiska och visuella parametrar, såsom ejakulat volym och koncentration, motilitet och progressiv motilitet, och spermiernas morfologi och. Ingen av dessa bedömningar är dock tillräckligt bra för att förutsäga sperma kvaliteten. Med tanke på att underhållet av spermier livskraft och befruktning potentiella beror på membran integritet och intracellulära funktionalitet, kan utvärdering av dessa parametrar aktivera en bättre Prediktion av spermier befruktning kompetens. Vi beskriver här, tre möjliga metoder för att utvärdera spermiernas kvalitet använder specifika fluorescerande sonder kombinerat med fluorescence mikroskopi eller flöde flödescytometri analyser. Analyser bedöms plasmamembranet integritet använder 4′, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) och propidium jodid (PI), acrosomal membran integritet med fluorescein isotiocyanat-konjugerad Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) och mitokondriella membranet integritet använder 5, 5′, 6, 6′-tetra-kloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine jodid (JC-1). Kombinationer av dessa metoder presenteras också. Exempelvis användning av annexin V kombinerat med PI fluorokromer gör bedömningen av apoptos och beräkning av andelen apoptotiska spermier (apoptotiska index). Vi anser att dessa metoder, som bygger på att undersöka spermie membran, är mycket användbart för utvärdering av spermiernas kvalitet.
Introduction
Integritet och funktionalitet av spermier membran är några av de faktorer som indikerar spermier livskraft och befruktning potentiella. Plasmamembranet fungerar som en barriär mellan intracellulär och extracellulär fack, därigenom bibehålla den cellulära osmotiska balans1. Stress som inducerar skador på plasmamembranet integritet kan försämra homeostas, minska livskraft och befruktning kapacitet och öka celldöd. Exempelvis minskar frysförvaring spermier lönsamhet på grund av skada till dess plasmamembran, till följd av temperaturväxlingar och osmotisk stress2. Tidigare rapporterade vi att utsätta bull spermier till låga koncentrationer av livsmedelsburna föroreningar såsom de bekämpningsmedel atrazin, dess huvudmetabolit diaminochlorotriazine eller den mykotoxin aflatoxin B1, minskar spermier livskraft1,3 . Detta bestämdes av märkning dubbelsträngat DNA med DAPI i kombination med PI, som binder till DNA celler med skadat plasma membran.
Akrosomen reaktion (AR) innebär fusion av yttre akrosomen membranet och överliggande plasmamembranet vilket resulterar i utsläpp av acrosomal enzymer4,5. Dessa är väsentliga händelser zona pellucida penetration och ytterligare sammanslagning av spermier med äggcellen6. Utvärdering av acrosomal membran integritet utgör därför en användbar parameter för att utvärdera sperma kvalitet och manlig fertilitet7,8,9. Flera fluorescerande tekniker är lämpliga för verifiering av akrosomen integritet, FITC-PNA eller FITC-PSA8,10. I våra tidigare studier, med mönster av FITC-PSA färgning1,3, vi förutsatt korrekt definitioner för (i) intakt akrosomen, (ii) skadats akrosomen membran och (iii) reagerade akrosomen. I det aktuella betänkandet vi utvärdera akrosomen status med hjälp av spermier-dedikerad flödescytometri och jämföra resultaten till de som använder fluorescensmikroskopi.
Mitokondrierna är multifunktionella organeller involverad i, bland annat ATP syntes, reaktivt syre arter produktion, Kalciumsignalering och apoptos. Fysiologiska störningar, inklusive manlig och kvinnlig infertilitet, är associerade med förändrad mitokondriefunktion11. Spermier mitokondrier är ordnade i midpiece och spelar en avgörande roll i spermier motilitet12. Det är väl accepterat att hög mitokondriella membranpotential (ΔΨm) är förknippad med normala motilitet och hög befruktning kapacitet13. Däremot låg ΔΨm är associerade med en förhöjd nivå av reaktiva syreradikaler och minskad gödsling ränta14. Ändå kan olika miljömässiga föreningar, till exempel hormonstörande ämnen, inducera cellulär stress och leda till en övergående förhöjning av ΔΨm, hyperpolarisering1,3, ökad produktion av fria radikaler och så småningom apoptos15. Fluorescerande sonden 5, 5′, 6, 6′-tetra-kloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine jodid (JC-1) möjliggör till exempel att undersöka effekterna av livsmedelsburna gifter på spermier ΔΨm1,3.
Standard spermiograms, utifrån fysiologiska och morfologiska parametrar, är inte tillräckligt bra för att förutsäga sperma kvalitet. Noggrannare metoder måste säkerställa spermiekvalitet. Här, vi ger två möjliga metoder för att bestämma spermiernas kvalitet baserat på utvärderingar av spermier membran: samtidiga Fyrbäddsrum färgning med specifika fluorescerande sonder och fluorescensmikroskopi, beskrivs i våra studier1,3 och avancerade spermier-dedikerad flödescytometri, nyligen används i vårt laboratorium, och redan används av andra16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spermier befruktning potentiella beror på flera faktorer avspeglar dess kvalitet. En hög koncentration av spermier och en hög andel mycket progressivt motila spermier kan anses hög kvalitet sperma. Dock sådan utvärdering tar inte hänsyn till andra cellulära och funktionella parametrar. Användningen av ‘bänk’ microcapillary flödescytometer kan lätt anpassas till utvärdering av olika spermier strukturer med fluorescerande sonder, som tidigare visat av andra17 och visade häri (teknik #3…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka ”SION” israeliska företaget för artificiell insemination och avel (Hafetz-Haim, Israel) för deras hjälp och samarbete och Ms. Li Na (IMV teknik, L’Aigle, Frankrike) för hjälp med instrumentet installation och utbildning.
Materials
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20X stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
Riferimenti
- Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
- Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
- Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
- Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
- Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
- Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
- Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
- Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
- Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
- Eddy, E. M., O’Brien, A. . The spermatozoon. , (1994).
- Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
- Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
- Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
- Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
- Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
- Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).
