Proteómica de arriba hacia abajo a gran escala mediante electroforesis capilar de zona Spectrometry total en tándem
Summary
Se describe un protocolo detallado para la separación, identificación y caracterización de proteoforms en muestras de proteínas utilizando la zona capilar electroforesis-electrospray ionización-spectrometry total en tándem (CZE-ESI-MS/MS). El protocolo puede utilizarse para la caracterización de alta resolución de proteoforms en las muestras de proteína simple y la identificación a gran escala de proteoforms en muestras complejas del proteoma.
Abstract
Zona capilar electroforesis-electrospray ionización-spectrometry total en tándem (CZE-ESI-MS/MS) ha sido reconocido como una herramienta útil para proteómica de arriba hacia abajo que tiene como objetivo caracterizar proteoforms en proteomas complejos. Sin embargo, la aplicación de CZE-MS/MS para proteómica de arriba hacia abajo a gran escala ha sido impedido por la baja capacidad de carga de muestra y estrecha ventana de separación de CZE. Aquí, se describe un protocolo mediante CZE-MS/MS con un volumen de muestra de carga escala microlitro y una ventana de separación de 90 min para proteómica a gran escala de arriba hacia abajo. La plataforma de CZE-MS/MS se basa en una poliacrilamida lineal (LPA)-revestido separación capilar con flujo electroosmotic extremadamente bajo, un método de concentración dinámica muestra en línea basado en el cruce de pH con una alta eficiencia para el amontonamiento de proteína, un electro-cinéticamente bombeado vaina flujo CE-MS interfaz con muy alta sensibilidad y un espectrómetro de masas de trampa de iones con alta resolución en masa y velocidad de exploración. La plataforma puede ser utilizada para la caracterización de alta resolución de muestras simple proteína intacta y la caracterización a gran escala de proteoforms en diversos proteomas complejos. Por ejemplo, demuestra una muy eficiente separación de una mezcla de proteína estándar y una detección muy sensible de muchas impurezas utilizando la plataforma. Otro ejemplo, esta plataforma puede producir más de 500 proteoform y 190 identificaciones de proteína de un proteoma de Escherichia coli en un CZE-MS/MS solo ejecutan.
Introduction
Proteómica de arriba hacia abajo (TDP) tiene como objetivo para la caracterización a gran escala de proteoforms dentro de un proteoma. TDP se basa en la separación de fase líquida efectiva de proteínas intactas antes de análisis de electrospray spectrometry total en tándem de ionización (ESI-MS/MS) debido a la alta complejidad y un rango dinámico de gran concentración del proteoma1,2 ,3,4,5. Electroforesis capilar de zona (CZE) es una técnica poderosa para la separación de biomoléculas basados en sus relaciones de tamaño de la carga6. CZE es relativamente simple, requiriendo sólo un abierto tubular fundido silicona capilar, un electrolito de fondo (BGE) y una fuente de alimentación. Una muestra de proteínas intactas se puede cargar en el capilar mediante presión o tensión, y separación se inicia sumergiendo ambos extremos del tubo capilar en el BGE y aplicando un alto voltaje. CZE puede acercarse a ultra alta eficacia de separación (> 1 millón de platos teóricos) para la separación de biomoléculas7. CZE-MS tiene una sensibilidad considerablemente mayor que la cromatografía líquida de fase inversa utilizada (RPLC)-MS para el análisis de proteínas intactas8. Aunque CZE-MS tiene un gran potencial para gran escala proteómica de arriba hacia abajo, su amplia aplicación en la proteómica ha sido impedido por varios asuntos, incluyendo una baja capacidad de carga de muestra y separación estrecha ventana. La muestra típica carga de volumen en CZE es alrededor del 1% del total del volumen capilar, que corresponde generalmente a menos de 100 nL9,10,11. La ventana de separación de CZE es generalmente menos de 30 minutos debido a la fuerte electroosmotic flujo (EF)9,10. Estos problemas limitan el CZE-MS/MS para la identificación de un gran número de proteoforms y bajo proteoforms abundante de un proteoma complejo.
Se ha realizado mucho esfuerzo para mejorar la muestra de carga volumen de CZE via online muestra concentración métodos (e.g., microextracción en fase sólida [SPME]12,13, muestra mayor campo apilando [tarifas]9 , 11 , 14y pH dinámico salida15,16,17,18). FESS y cruce de pH dinámicos son más simples que la SPME, requiriendo sólo una diferencia significativa entre el tampón y el BGE en conductividad y pH. FESS emplea un tampón con mucho menor conductividad que el BGE, llevando a un apilamiento de analitos en el límite entre la zona de muestra y la zona BGE en el capilar. Cruce de pH dinámica utiliza un enchufe básico muestra (p. ej., bicarbonato de amonio 50 mM, pH 8) y un ácido BGE (p. ej., ácido acético al 5% [v/v], pH 2.4) a ambos lados de la toma de muestra. Aplicación de un alto voltaje positivo al final de la inyección del tubo capilar, valoración de la toma de la muestra básica ocurre, concentrando los analitos en un tapón apretado antes de someterse a una separación de CZE. Recientemente, el grupo sol sistemáticamente en comparación con FESS y cruce de pH dinámico para el apilamiento en línea de proteínas intactas, demostrar ese cruce de pH dinámica podría producir mucho mejor rendimiento que las tarifas para la línea concentración de proteínas intactas cuando el volumen de inyección de muestra fue de 25% del volumen capilar total19.
Separación neutral revestido capilares (p. ej., poliacrilamida lineal [LPA]) han sido empleados para reducir la EF en los capilares, ralentizando la separación CZE y ampliar la ventana de separación20,21. Recientemente, el grupo de primaria desarrollado un procedimiento simple para la preparación de la capa estable de LPA en la pared interior de los capilares, utilizando persulfato de amonio (APS) como el iniciador y la temperatura (50 ° C) para la producción de radicales libres y polimerización22 . Muy recientemente, el grupo sol emplea la separación recubierto de LPA capilar y el método de cruce de pH dinámico para la separación de CZE de proteínas intactas, llegando a una muestra de microlitro escala carga de volumen y una separación de 90 min ventana19. Este sistema CZE abre la puerta al uso de CZE-MS/MS para proteómica a gran escala de arriba hacia abajo.
CZE-MS requiere una interfaz altamente robusta y sensible a pareja CZE a MS. Tres interfaces de CE-MS han sido bien desarrollados y comercializados en la historia de la EM de la CE, y son la vaina co-axial-flow interfaz23, la interfaz de sheathless usando una punta porosa como el ESI emisor24y el electro-cinéticamente bombeado de la envoltura de flujo interfaz25,26. El electro-cinéticamente bombeada vaina-flujo-basada en interfaz CZE-MS/MS ha alcanzado una baja zeptomoles péptido detección límite9, más 10.000 identificaciones del péptido (IDs) de la HeLa proteoma en un solo funcionamiento14, una caracterización rápida de la célula de proteínas intactas11y muy estables y reproducibles de análisis de biomoléculas26. Recientemente, el capilar de separación LPA-revestido, el método de cruce de pH dinámico y la interfaz de flujo de bombeo electro-cinéticamente vaina fueron destinados a gran escala proteómica de arriba hacia abajo de un proteoma de Escherichia coli (e. coli)19 ,27. La plataforma de CZE-MS/MS acercaron más de 500 proteoform IDs en un solo funcionamiento19 y casi 6.000 proteoform IDs mediante acoplamiento con Cromatografía por exclusión de tamaño (SEC)-TAGATOSA fraccionamiento27. Los resultados demuestran claramente la capacidad de CZE-MS/MS para proteómica a gran escala de arriba hacia abajo.
En este documento, se describe un procedimiento detallado de usar CZE-MS/MS para proteómica a gran escala de arriba hacia abajo. El CZE-MS/MS sistema emplea el tubo capilar recubierto de LPA para reducir la EF en el capilar, el método de cruce de pH dinámico para determinar la concentración de proteínas, la interfaz de flujo de electro-cinéticamente bombeado vaina para acoplamiento CZE a MS, un orbitrap en línea masa Espectrómetro para la colección de espectros MS y MS/MS de las proteínas y un software de TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform identificación y caracterización) para proteoform ID vía búsqueda base de datos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí proporcionamos un protocolo detallado para utilizar CZE-MS/MS para la caracterización de alta resolución de proteoforms en las muestras de proteína simple y para la identificación a gran escala de proteoforms en muestras complejas del proteoma. En la figura 1muestra un diagrama del sistema CZE-ESI-MS/MS. Hay cuatro pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, la preparación de recubrimiento de alta calidad LPA en la pared interior de separación capilar es muy importante. Una…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a grupo de Heedeok Hong en el Departamento de química, Universidad Estatal de Michigan, por proporcionar amablemente las células de Escherichia coli para los experimentos. Los autores agradecen el apoyo del Instituto Nacional de Ciencias de Medicina General, los institutos nacionales de salud (NIH) a través de Grant R01GM118470 (a X. Liu) y Grant R01GM125991 (a l el sol y X. Liu).
Materials
| Fused silica capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | 50 µm i.d. 360 µm o.d. |
| Sodium hydroxide pellets | Macron Fine Chemicals | 7708-10 | Corrosive |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA48-1 | Corrosive |
| Methanol | Fisher Scientific | A456-4 | Toxic, Health Hazard |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M6514 | Moisture and heat sensitive |
| Hydrofluoric acid | Acros Organics | 423805000 | Highy toxic |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic, health hazard |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | Health hazard, Oxidizer |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Cytochrome C | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| ß-casein | Sgma-Aldrich | C6905 | |
| Carbonic anhydrase | Sigma-Aldrich | C3934 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Urea | Alfa Aesar | 36428-36 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Health Hazard |
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122270250 | Health Hazard |
| Formic Acid | Fisher Scientific | A117-50 | Corrosive, Health Hazard |
| C4 trap column | Sepax Technologies | 110043-4001C | 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998SK-4 | Toxic, Oxidizer |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 1066-33-7 | |
| Nalgene rapid-flow filters | Thermo Scientific | 126-0020 | 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter |
| E. coli cells | K-12 MG1655 | ||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23250 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | |
| HPLC system for protein desalting | Agilient | 1260 Infinity II | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| CE autosampler | CMP Scientific | ECE-001 | |
| Electro-kinetically pumped sheath flow interface | CMP Scientific | ||
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sutter flaming/brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Ultrasonic cell disruptor for cell lysis | Branson | 101063196 | Model S-250A |
| Vaccum concentrator | Thermo Fisher Scientific | SPD131DDA-115 |
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