JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chimica

Büyük ölçekli tepeden proteomik kılcal bölge Elektroforez Tandem kütle spektrometresi kullanılarak

Published: October 24, 2018
doi:
10.3791/58644
, , , , ,
1Department of Chemistry,Michigan State University, 2Department of BioHealth Informatics,Indiana University-Purdue University Indianapolis, 3Center for Computational Biology and Bioinformatics,Indiana University School of Medicine

Summary

Detaylı bir protokol ayırma, kimlik ve kapiller bölge Elektroforez-electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (CZE-ESI-MS/MS) kullanarak protein örnekleri proteoforms karakterizasyonu için tanımlanır. Protokol proteoforms basit protein örneklerinde yüksek çözünürlüklü karakterizasyonu ve proteoforms karmaşık Proteom örneklerinde büyük ölçekli tanımlaması için kullanılabilir.

Abstract

Kapiller bölge Elektroforez-electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (CZE-ESI-MS/MS) karmaşık proteomes proteoforms karakterize amaçlamaktadır tepeden proteomik için yararlı bir araç olarak kabul edilmiştir. Ancak, CZE-MS/MS uygulama için büyük ölçekli tepeden proteomik düşük örnek yükleme kapasitesi ile engelledi ve CZE ayrılık pencere dar. Burada, bir protokol CZE-MS/MS microliter ölçekli örnek yükleme hacmi ve bir 90 dk ayrılık pencere ile büyük ölçekli tepeden proteomik için kullanılarak açıklanmıştır. Bir doğrusal polyacrylamide (LPA) tabanlı CZE-MS/MS platformu-kaplamalı ayırma ile son derece düşük electroosmotic akışı, protein istifleme, pH-kavşak tabanlı dinamik online örneği konsantrasyon yöntemi yüksek verimlilik ile kılcal bir Elektro-kinetically pompalanan kılıf akışı CE-MS arayüzü ile son derece yüksek hassasiyet ve bir iyon kapanı kütle spektrometre ile yüksek çözünürlük kitle ve hız tarayın. Platform, basit sağlam protein örnekleri yüksek çözünürlüklü karakterizasyonu ve proteoforms çeşitli karmaşık proteomes içinde büyük ölçekli karakterizasyonu için kullanılabilir. Örneğin, bir standart protein karışımı son derece verimli bir ayrılması ve son derece hassas bir platform kullanılarak birçok yabancı maddelerin tespiti gösterilmiştir. Başka bir örnek olarak, bu platform 500’den fazla proteoform üretebilir ve 190 protein tanımlamaları bir Escherichia coli Proteom bir tek CZE-MS/MS üzerinden çalıştırın.

Introduction

Proteoforms bir Proteom içinde büyük ölçekli karakterizasyonu için yukarıdan aşağıya proteomik (TDP) amaçlamaktadır. TDP electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (ESI-MS/MS) analizi yüksek karmaşıklık nedeniyle daha önce olduğu gibi proteinler etkili sıvı faz ayrılması ve büyük konsantrasyon Proteom1,2 dinamik aralığını kullanır ,3,4,5. Kapiller bölge Elektroforez (CZE) üzerinde onların boyutu ücret oranları6dayalı biomolecules ayrılması için güçlü bir tekniktir. CZE nispeten yalnızca bir açık borulu erimiş silis kapiller, bir arka plan elektrolit (BGE) ve bir güç kaynağı gerektiren basittir. Bir örnek olduğu gibi proteinlerin kapiller basınç veya gerilim kullanarak yüklenebilir ve ayırma her iki ucunda da BGE kılcal çeker ve bir yüksek gerilim uygulayarak başlatılır. CZE Ultra yüksek ayırma verimliliği yaklaşım (> 1 milyon teorik plakaları) biomolecules7ayrılması için. CZE-MS vardır büyük ölçüde daha yüksek bir hassasiyet daha yaygın olarak kullanılan ters fazlı sıvı kromatografi (RPLL)-analizi için MS sağlam proteinler8. CZE-MS büyük ölçekli tepeden proteomik için büyük bir potansiyele sahip olsa da, proteomik geniş kendi uygulamasında bir düşük örnek yükleme kapasitesi ve dar ayrılık pencere de dahil olmak üzere birkaç sorunu tarafından engellemiştir. Yükleme hacmi CZE içinde tipik örneğidir genellikle 100 nL9,10‘ a,11karşılık gelen toplam kapiller hacmi yaklaşık % 1. CZE ayrılık pencere genellikle az 30 dk güçlü electroosmotic akışı (EOF)9,10nedeniyle var. Bu sorunlar CZE-MS/MS çok sayıda proteoforms ve karmaşık bir Proteom üzerinden düşük bol proteoforms tanımlanması için sınırlayın.

Yükleme hacmi CZE üzerinden online örnek toplama yöntemleri (Örneğin, katı fazlı microextraction [SPME]12,13, örnek alan Gelişmiş yığın [FESS]9 örnek geliştirmek için çok çaba yapıldığı yeri , 11 , 14ve dinamik pH kavşak15,16,17,18). FESS ve dinamik pH kavşak SPME, sadece örnek arabellek ve BGE arasında önemli bir fark iletkenlik ve pH gerektiren daha basit. FESS analitler örnek bölge ve kılcal BGE bölgesinde arasındaki sınır üzerinde istifleme için önde gelen BGE daha fazla düşük iletkenlik ile bir örnek arabelleği kullanır. Dinamik pH kavşak bir temel örnek fiş (Örneğin, 50 mM Amonyum Bikarbonat, pH 8) ve örnek tak her iki tarafında asidik bir BGE (Örneğin, [v/v] % 5 asetik asit, pH 2.4) kullanır. Kılcal enjeksiyon sonunda yüksek pozitif gerilim başvuru üzerine, titrasyon temel örnek fiş, CZE ayrılık geçiyor önce sıkı bir fiş analitler odaklanan oluşur. Son zamanlarda, Güneş Grup sistematik FESS ve dinamik pH kavşak online olduğu gibi proteinlerin istifleme için bu dinamik pH kavşak üretmek FESS sağlam proteinler çevrimiçi konsantrasyon için daha çok iyi performans gösteren göre ne zaman numune enjeksiyon hacmi toplam kılcal birim%1925’i oldu.

Yansıtmaya kaplamalı ayrılık kılcal damarlar (Örneğin, doğrusal polyacrylamide [LPA]) CZE ayrılık yavaş ve ayrılık pencere20,21genişletme EOF kılcal içinde azaltmak için istihdam edilmiştir. Son zamanlarda, Dovichi grup kılcal damarlar, iç duvar üzerinde istikrarlı LPA kaplama hazırlanması için basit bir prosedür amonyum Persülfat (APS) kullanan Başlatıcı ve serbest radikal üretimi ve polimerizasyon22 için sıcaklık (50 ° C) olarak geliştirilen . Çok yakın zamanda, Güneş grup yükleme birimi ve bir 90 dk ayrılık pencere19microliter-ölçek örnek ulaşan LPA kaplı ayrılık kapiller ve dinamik pH kavşak yöntemi olduğu gibi proteinlerin CZE ayrılması için istihdam. Bu CZE sistemini CZE-MS/MS için büyük ölçekli tepeden proteomik kullanarak için kapıyı açar.

CZE-MS Çift CZE MS için son derece sağlam ve hassas bir arayüzü gerektirmektedir. Üç CE-MS arabirimi de gelişmiş ve CE-MS tarihinde ticari olmuştur, ve onlar koaksiyel kılıf-akış arabirimi23, gözenekli bahşiş ESI emitör24, kullanarak sheathless arayüzü ve elektro-kinetically pompalanan kılıf akış arabirimi25,26. Elektro-kinetically pompalanan kılıf-akış arabirimi-tabanlı CZE-MS/MS düşük zeptomole peptid algılama sınırı9ulaştı, 10.000’den fazla peptid tanımlamaları (IDS) üzerinden HeLa Proteom14, hızlı bir karakterizasyonu çalıştırmak tek bir hücre sağlam proteinler11ve son derece istikrarlı ve tekrarlanabilir analizleri biomolecules26. Son zamanlarda, ayrılık LPA kaplı kılcal, dinamik pH kavşak yöntemi ve elektro-kinetically pompalanan kılıf akış arabirimi bir Escherichia coli (e.coli) Proteom19 büyük ölçekli tepeden proteomik için kullanılan ,27. 500’den fazla proteoform kimlikleri tek bir19 ve boyutu-dışlama Kromatografi (sn) ile kaplin yaklaşık 6.000 proteoform kimlikleri üzerinden çalıştırmak CZE-MS/MS platform yaklaştı-RPLL ayırma27. Sonuçlar açıkça CZE-MS/MS yeteneği için büyük ölçekli tepeden proteomik gösterir.

Burada, CZE-MS/MS için büyük ölçekli tepeden proteomik kullanmanın ayrıntılı bir yordam açıklanır. CZE-MS/MS sistem EOF kılcal, proteinler, MS, bir orbitrap CZE kaplin için elektro-kinetically pompalanan kılıf akış arabirimi çevrimiçi konsantrasyon için dinamik pH kavşak yöntemi içinde azaltmak için LPA kaplı kılcal istihdam kitle Spektrometre proteinlerin ve proteoform kimliği ile veritabanı arama için a sendelemek (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform kimlik ve karakterizasyonu) bilgisayar yazılımı MS ve MS/MS spectra koleksiyonu için.

Protocol

1. ayrılık kılcal iç duvarında LPA kaplama hazırlanması Kılcal Önarıtma Erimiş silis kılcal (120 cm uzunluğunda, 50 µm iç çapı [kimlik], dış çapı [doz] 360 µm) art arda 500 µL 1 M sodyum hidroksit, deiyonize su, 1 M hidroklorik asit, deiyonize su ve bir şırınga pompa kullanarak LC-MS sınıf metanol ile yıkayın. Azot Gazı (10 PSI, ≥ 12 h) ile kılcal kuru ve kılcal (v/v) 3-(trimethoxysilyl) % 50 ile doldurmak propil metakrilat bir şırınga…

Representative Results

Şekil 1 bir diyagram deneyde kullanılan dinamik pH Kavşağı-tabanlı sisteminin CZE-ESI-MS gösterir. Temel bir arabellek örnekte uzun bir fiş bir asidik BGE ile dolu bir LPA kaplı ayrılık kılcal damar içine enjekte edilir. Yüksek voltaj uygulandıktan sonra ı ve II, örnek bölge içindeki analitler konsantre yolu ile dinamik pH kavşak yöntemi olacaktır. CZE-MS sistem performansını değerlendirmek için bir standart protein karış…

Discussion

Burada CZE-MS/MS proteoforms basit protein örneklerinde yüksek çözünürlüklü karakterizasyonu ve proteoforms karmaşık Proteom örneklerinde büyük ölçekli tanımlaması için kullanmak için detaylı bir protokol sağlar. Bir diyagramı CZE-ESI-MS/MS sisteminin Şekil 1‘ de gösterilen. İletişim kuralında dört kritik adım vardır. İlk olarak, yüksek kaliteli LPA kaplama kapiller ayrılması iç duvarda hazırlanması son derece önemlidir. Bir LPA kaplı ayrılık kılcal …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Heedeok Hong’un grubu Michigan State University, Kimya Bölümü, nazikçe Escherichia coli hücreleri deneyler için verdiğiniz için teşekkür ederiz. Yazarlar genel tıbbi Bilimler Ulusal Enstitüsü, ulusal kurumları sağlık (NIH) Grant R01GM118470 (için X. Liu) ve Grant R01GM125991 destek (L. güneş ve X. Liu için) teşekkür ederiz.

Materials

Fused silica capillary Polymicro Technologies 1068150017 50 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pellets Macron Fine Chemicals 7708-10 Corrosive
LC-MS grade water Fisher Scientific W6-1
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA48-1 Corrosive
Methanol Fisher Scientific A456-4 Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma-Aldrich M6514 Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acid Acros Organics 423805000 Highy toxic
Acrylamide Acros Organics 164855000 Toxic, health hazard
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678 Health hazard, Oxidizer
lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Cytochrome C Sigma-Aldrich C7752
Myoglobin Sigma-Aldrich M1882
ß-casein Sgma-Aldrich C6905
Carbonic anhydrase Sigma-Aldrich C3934
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153
Urea Alfa Aesar 36428-36
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632 Health Hazard
Iodoacetamide Fisher Scientific AC122270250 Health Hazard
Formic Acid Fisher Scientific A117-50 Corrosive, Health Hazard
C4 trap column Sepax Technologies 110043-4001C 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
Acetonitrile Fisher Scientific A998SK-4 Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 1066-33-7
Nalgene rapid-flow filters Thermo Scientific 126-0020 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cells K-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich D8537
BCA assay Thermo Scientific 23250
Acetone Fisher Scientific A11-1
HPLC system for protein desalting Agilient 1260 Infinity II
Acetic Acid Fisher Scientific A38-212
CE autosampler CMP Scientific ECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interface CMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette puller Sutter Instruments P-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysis Branson 101063196 Model S-250A
Vaccum concentrator Thermo Fisher Scientific SPD131DDA-115
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Aebersold, R., et al. How many proteoforms are there. Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).
  2. Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).
  3. Catherman, A. D., et al. Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence. Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).
  4. Cai, W., et al. Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy. Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).
  5. Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).
  6. Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. Capillary Zone Electrophoresis. Science. 222 (4621), 266-272 (1983).
  7. Keithley, R. B. Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism. Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).
  8. Han, X., et al. In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).
  9. Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests. Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).
  10. Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Muñoz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).
  11. Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).
  12. Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).
  13. Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes. Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).
  14. Sun, L., et al. Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).
  15. Aebersold, R., Morrison, H. D. Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).
  16. Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction. Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).
  17. Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).
  18. Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).
  19. Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms. Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).
  20. Busnel, J. M. High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis. Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).
  21. Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).
  22. Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry. Talanta. 146, 839-843 (2016).
  23. Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).
  24. Moini, M. Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip. Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).
  25. Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).
  26. Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
  27. McCool, E. N., et al. Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome. Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).
  28. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  29. Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).
  30. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  31. Ansong, C., et al. Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).
  32. Shen, Y., et al. High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics. Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).
  33. Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).
  34. Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).
  35. Shaw, J. B., et al. Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).

Tags

ProteomicsCapillary Zone ElectrophoresisMass SpectrometryProtein IsoformsProtein Post-translational ModificationsSample PreparationCapillary CoatingCapillary EtchingCZE System Setup

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
McCool, E. N., Lubeckyj, R., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (140), e58644, doi:10.3791/58644 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image