Detaylı bir protokol ayırma, kimlik ve kapiller bölge Elektroforez-electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (CZE-ESI-MS/MS) kullanarak protein örnekleri proteoforms karakterizasyonu için tanımlanır. Protokol proteoforms basit protein örneklerinde yüksek çözünürlüklü karakterizasyonu ve proteoforms karmaşık Proteom örneklerinde büyük ölçekli tanımlaması için kullanılabilir.
Kapiller bölge Elektroforez-electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (CZE-ESI-MS/MS) karmaşık proteomes proteoforms karakterize amaçlamaktadır tepeden proteomik için yararlı bir araç olarak kabul edilmiştir. Ancak, CZE-MS/MS uygulama için büyük ölçekli tepeden proteomik düşük örnek yükleme kapasitesi ile engelledi ve CZE ayrılık pencere dar. Burada, bir protokol CZE-MS/MS microliter ölçekli örnek yükleme hacmi ve bir 90 dk ayrılık pencere ile büyük ölçekli tepeden proteomik için kullanılarak açıklanmıştır. Bir doğrusal polyacrylamide (LPA) tabanlı CZE-MS/MS platformu-kaplamalı ayırma ile son derece düşük electroosmotic akışı, protein istifleme, pH-kavşak tabanlı dinamik online örneği konsantrasyon yöntemi yüksek verimlilik ile kılcal bir Elektro-kinetically pompalanan kılıf akışı CE-MS arayüzü ile son derece yüksek hassasiyet ve bir iyon kapanı kütle spektrometre ile yüksek çözünürlük kitle ve hız tarayın. Platform, basit sağlam protein örnekleri yüksek çözünürlüklü karakterizasyonu ve proteoforms çeşitli karmaşık proteomes içinde büyük ölçekli karakterizasyonu için kullanılabilir. Örneğin, bir standart protein karışımı son derece verimli bir ayrılması ve son derece hassas bir platform kullanılarak birçok yabancı maddelerin tespiti gösterilmiştir. Başka bir örnek olarak, bu platform 500’den fazla proteoform üretebilir ve 190 protein tanımlamaları bir Escherichia coli Proteom bir tek CZE-MS/MS üzerinden çalıştırın.
Proteoforms bir Proteom içinde büyük ölçekli karakterizasyonu için yukarıdan aşağıya proteomik (TDP) amaçlamaktadır. TDP electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (ESI-MS/MS) analizi yüksek karmaşıklık nedeniyle daha önce olduğu gibi proteinler etkili sıvı faz ayrılması ve büyük konsantrasyon Proteom1,2 dinamik aralığını kullanır ,3,4,5. Kapiller bölge Elektroforez (CZE) üzerinde onların boyutu ücret oranları6dayalı biomolecules ayrılması için güçlü bir tekniktir. CZE nispeten yalnızca bir açık borulu erimiş silis kapiller, bir arka plan elektrolit (BGE) ve bir güç kaynağı gerektiren basittir. Bir örnek olduğu gibi proteinlerin kapiller basınç veya gerilim kullanarak yüklenebilir ve ayırma her iki ucunda da BGE kılcal çeker ve bir yüksek gerilim uygulayarak başlatılır. CZE Ultra yüksek ayırma verimliliği yaklaşım (> 1 milyon teorik plakaları) biomolecules7ayrılması için. CZE-MS vardır büyük ölçüde daha yüksek bir hassasiyet daha yaygın olarak kullanılan ters fazlı sıvı kromatografi (RPLL)-analizi için MS sağlam proteinler8. CZE-MS büyük ölçekli tepeden proteomik için büyük bir potansiyele sahip olsa da, proteomik geniş kendi uygulamasında bir düşük örnek yükleme kapasitesi ve dar ayrılık pencere de dahil olmak üzere birkaç sorunu tarafından engellemiştir. Yükleme hacmi CZE içinde tipik örneğidir genellikle 100 nL9,10‘ a,11karşılık gelen toplam kapiller hacmi yaklaşık % 1. CZE ayrılık pencere genellikle az 30 dk güçlü electroosmotic akışı (EOF)9,10nedeniyle var. Bu sorunlar CZE-MS/MS çok sayıda proteoforms ve karmaşık bir Proteom üzerinden düşük bol proteoforms tanımlanması için sınırlayın.
Yükleme hacmi CZE üzerinden online örnek toplama yöntemleri (Örneğin, katı fazlı microextraction [SPME]12,13, örnek alan Gelişmiş yığın [FESS]9 örnek geliştirmek için çok çaba yapıldığı yeri , 11 , 14ve dinamik pH kavşak15,16,17,18). FESS ve dinamik pH kavşak SPME, sadece örnek arabellek ve BGE arasında önemli bir fark iletkenlik ve pH gerektiren daha basit. FESS analitler örnek bölge ve kılcal BGE bölgesinde arasındaki sınır üzerinde istifleme için önde gelen BGE daha fazla düşük iletkenlik ile bir örnek arabelleği kullanır. Dinamik pH kavşak bir temel örnek fiş (Örneğin, 50 mM Amonyum Bikarbonat, pH 8) ve örnek tak her iki tarafında asidik bir BGE (Örneğin, [v/v] % 5 asetik asit, pH 2.4) kullanır. Kılcal enjeksiyon sonunda yüksek pozitif gerilim başvuru üzerine, titrasyon temel örnek fiş, CZE ayrılık geçiyor önce sıkı bir fiş analitler odaklanan oluşur. Son zamanlarda, Güneş Grup sistematik FESS ve dinamik pH kavşak online olduğu gibi proteinlerin istifleme için bu dinamik pH kavşak üretmek FESS sağlam proteinler çevrimiçi konsantrasyon için daha çok iyi performans gösteren göre ne zaman numune enjeksiyon hacmi toplam kılcal birim%1925’i oldu.
Yansıtmaya kaplamalı ayrılık kılcal damarlar (Örneğin, doğrusal polyacrylamide [LPA]) CZE ayrılık yavaş ve ayrılık pencere20,21genişletme EOF kılcal içinde azaltmak için istihdam edilmiştir. Son zamanlarda, Dovichi grup kılcal damarlar, iç duvar üzerinde istikrarlı LPA kaplama hazırlanması için basit bir prosedür amonyum Persülfat (APS) kullanan Başlatıcı ve serbest radikal üretimi ve polimerizasyon22 için sıcaklık (50 ° C) olarak geliştirilen . Çok yakın zamanda, Güneş grup yükleme birimi ve bir 90 dk ayrılık pencere19microliter-ölçek örnek ulaşan LPA kaplı ayrılık kapiller ve dinamik pH kavşak yöntemi olduğu gibi proteinlerin CZE ayrılması için istihdam. Bu CZE sistemini CZE-MS/MS için büyük ölçekli tepeden proteomik kullanarak için kapıyı açar.
CZE-MS Çift CZE MS için son derece sağlam ve hassas bir arayüzü gerektirmektedir. Üç CE-MS arabirimi de gelişmiş ve CE-MS tarihinde ticari olmuştur, ve onlar koaksiyel kılıf-akış arabirimi23, gözenekli bahşiş ESI emitör24, kullanarak sheathless arayüzü ve elektro-kinetically pompalanan kılıf akış arabirimi25,26. Elektro-kinetically pompalanan kılıf-akış arabirimi-tabanlı CZE-MS/MS düşük zeptomole peptid algılama sınırı9ulaştı, 10.000’den fazla peptid tanımlamaları (IDS) üzerinden HeLa Proteom14, hızlı bir karakterizasyonu çalıştırmak tek bir hücre sağlam proteinler11ve son derece istikrarlı ve tekrarlanabilir analizleri biomolecules26. Son zamanlarda, ayrılık LPA kaplı kılcal, dinamik pH kavşak yöntemi ve elektro-kinetically pompalanan kılıf akış arabirimi bir Escherichia coli (e.coli) Proteom19 büyük ölçekli tepeden proteomik için kullanılan ,27. 500’den fazla proteoform kimlikleri tek bir19 ve boyutu-dışlama Kromatografi (sn) ile kaplin yaklaşık 6.000 proteoform kimlikleri üzerinden çalıştırmak CZE-MS/MS platform yaklaştı-RPLL ayırma27. Sonuçlar açıkça CZE-MS/MS yeteneği için büyük ölçekli tepeden proteomik gösterir.
Burada, CZE-MS/MS için büyük ölçekli tepeden proteomik kullanmanın ayrıntılı bir yordam açıklanır. CZE-MS/MS sistem EOF kılcal, proteinler, MS, bir orbitrap CZE kaplin için elektro-kinetically pompalanan kılıf akış arabirimi çevrimiçi konsantrasyon için dinamik pH kavşak yöntemi içinde azaltmak için LPA kaplı kılcal istihdam kitle Spektrometre proteinlerin ve proteoform kimliği ile veritabanı arama için a sendelemek (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform kimlik ve karakterizasyonu) bilgisayar yazılımı MS ve MS/MS spectra koleksiyonu için.
Burada CZE-MS/MS proteoforms basit protein örneklerinde yüksek çözünürlüklü karakterizasyonu ve proteoforms karmaşık Proteom örneklerinde büyük ölçekli tanımlaması için kullanmak için detaylı bir protokol sağlar. Bir diyagramı CZE-ESI-MS/MS sisteminin Şekil 1‘ de gösterilen. İletişim kuralında dört kritik adım vardır. İlk olarak, yüksek kaliteli LPA kaplama kapiller ayrılması iç duvarda hazırlanması son derece önemlidir. Bir LPA kaplı ayrılık kılcal …
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Heedeok Hong’un grubu Michigan State University, Kimya Bölümü, nazikçe Escherichia coli hücreleri deneyler için verdiğiniz için teşekkür ederiz. Yazarlar genel tıbbi Bilimler Ulusal Enstitüsü, ulusal kurumları sağlık (NIH) Grant R01GM118470 (için X. Liu) ve Grant R01GM125991 destek (L. güneş ve X. Liu için) teşekkür ederiz.
Fused silica capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | 50 µm i.d. 360 µm o.d. |
Sodium hydroxide pellets | Macron Fine Chemicals | 7708-10 | Corrosive |
LC-MS grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA48-1 | Corrosive |
Methanol | Fisher Scientific | A456-4 | Toxic, Health Hazard |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M6514 | Moisture and heat sensitive |
Hydrofluoric acid | Acros Organics | 423805000 | Highy toxic |
Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic, health hazard |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | Health hazard, Oxidizer |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Cytochrome C | Sigma-Aldrich | C7752 | |
Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
ß-casein | Sgma-Aldrich | C6905 | |
Carbonic anhydrase | Sigma-Aldrich | C3934 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Urea | Alfa Aesar | 36428-36 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Health Hazard |
Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122270250 | Health Hazard |
Formic Acid | Fisher Scientific | A117-50 | Corrosive, Health Hazard |
C4 trap column | Sepax Technologies | 110043-4001C | 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A998SK-4 | Toxic, Oxidizer |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 1066-33-7 | |
Nalgene rapid-flow filters | Thermo Scientific | 126-0020 | 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter |
E. coli cells | K-12 MG1655 | ||
Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23250 | |
Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | |
HPLC system for protein desalting | Agilient | 1260 Infinity II | |
Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
CE autosampler | CMP Scientific | ECE-001 | |
Electro-kinetically pumped sheath flow interface | CMP Scientific | ||
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Sutter flaming/brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
Ultrasonic cell disruptor for cell lysis | Branson | 101063196 | Model S-250A |
Vaccum concentrator | Thermo Fisher Scientific | SPD131DDA-115 |