Localisation du Locus Coeruleus dans le cerveau de souris
Summary
Le locus coeruleus est un petit amas de neurones impliqués dans divers processus physiologiques. Nous décrivons ici un protocole visant à préparer les sections de cerveau de souris pour l’étude des protéines et des métaux dans ce noyau.
Abstract
Le locus coeruleus (LC) est un centre majeur de norépinéphrine produisant des neurones qui modulent un certain nombre de fonctions physiologiques. Des anomalies structurelles ou fonctionnelles de LC impact de plusieurs régions du cerveau, y compris le cortex, hippocampe et le cervelet et peuvent contribuer à la dépression, le trouble bipolaire, l’anxiété, ainsi que la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer. Ces troubles sont souvent associés à déséquilibre métal, mais le rôle des métaux dans LC n’est que partiellement compris. Des études morphologiques et fonctionnelles de LC sont nécessaires pour mieux comprendre les pathologies humaines et la contribution des métaux. Les souris sont un modèle expérimental largement utilisé, mais la souris LC est petite (~0.3 mm de diamètre) et difficiles à identifier pour un non-spécialiste. Nous décrivons ici un protocole étape par étape l’immunohistochimie pour localiser la LC dans le cerveau de souris. Dopamine-β-hydroxylase (DBH) et, subsidiairement, tyrosine hydroxylase (TH), les deux enzymes fortement exprimées dans le LC, sont utilisés comme marqueurs immunohistochimiques dans des tranches de cerveau. Les sections adjacentes aux parties contenant les LC peuvent être utilisées pour une analyse ultérieure, y compris histologie pour études morphologiques, tests métaboliques, ainsi que l’imagerie metal par microscopie de fluorescence de rayons x (XFM).
Introduction
Le locus coeruleus (LC) est une région importante dans le tronc cérébral et un important site de production de noradrénaline (na)1. Le LC envoie des projections dans tout le cerveau2 vers le cortex, l’hippocampe et le cervelet3 et régule les processus physiologiques majeurs, y compris le rythme circadien4,5, attention et mémoire6, insister sur7, les processus cognitifs8et émotion9,10. Dysfonctionnement de LC a été impliqué dans les troubles neurologiques et neuropsychiatriques11, y compris Parkinson maladie12,13,14, de la maladie d’Alzheimer14, dépression15 ,16,17, trouble bipolaire18,19et anxiété20,21,22,23, 24. compte tenu de ces rôles, l’analyse de LC est essentiel à l’étude de sa fonction ou la dysfonction.
Souris sont largement utilisés pour l’étude des processus physiologiques et physiopathologiques. En raison de leur petite taille, la souris LC a un diamètre moyen de ~ 300 μm, menant à mal à trouver la structure. Au cours de la coupe de cerveau, la LC peut facilement manquer dans les sections sagittales ou coronales. Les études disponibles décrivant l’identification de LC chez les animaux n’offrent pas un protocole étape par étape que non-spécialiste peut suivre1,25. Ainsi, pour donner des orientations pour la localisation de la LC, les auteurs décrivent un protocole que nous avons développées pour localiser cette région dans le cerveau de souris pour plusieurs applications (Figure 1, Figure 2, , Figure 3). Le protocole s’applique soigneusement contrôlées cerveau sectionnement et immunohistochemical détection de DHP26,27, ou alternativement TH24, les deux enzymes hautement enrichis dans le LC28. Une fois que LC est situé par immunohistochimie, tranches de cerveau adjacent peuvent être utilisés pour poursuivre ses études, y compris des analyses morphologiques et métaboliques, ainsi que des études d’imagerie metal via x-Ray fluorescence microscopy (XFM)29. Nous décrivons XFM à titre d’exemple dans ce protocole (Figure 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Orienter correctement le spécimen est une étape cruciale dans le présent protocole. Parce que nous utilisons des caractéristiques anatomiques de la surface dorsale du cerveau pour localiser LC (frontière entre le cervelet et le colliculus inférieur), il est important que les sections aligner correctement. Cela nécessite des soins pour fixer correctement le cerveau dans la matrice de trancheuse de cerveau de souris. Nous recommandons de couper ~ 500 μm tissu plus antérieur et postérieur à LC pour éviter le man…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Abigael Muchenditsi pour l’entretien de la colonie de souris. Utilisation de l’Advanced Photon Source Argonne National Laboratory a été appuyée par le U.S. Department of Energy, Office of Science, Office d’énergie Sciences fondamentales, sous le numéro de contrat : AC02-DE-06CH11357. Nous remercions Olga Antipova et Dr Stefan Vogt pour assistance à l’utilisateur et l’aide à l’Advanced Photon Source. Ce travail a été financé par le National Institute of Health grant 2R01GM101502 de SL.
Materials
| Adult mouse brain slicer matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source – donkey) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Charged glass slides | Genesee | 29-107 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Cryostat cutting blades | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Scissors Mini, 9.5cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – inhouse production (source – rabbit) | B. Eipper | – | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – commercially availabe (source – rabbit) | Cell Signaling | 8586 | |
| Falcon tubes, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
| Forane (isofluorane) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Forceps Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset mounting media | EM sciences | 17984-24 | |
| Microscope | Pascal | LSM 5 | |
| Multi-well plates, 24 wells | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Optimal cutting temperature compound (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Pencil brush | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Razor blades | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Spatulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T pins | Office Depot | 344615 | |
| The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (to prepare PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source – rabbit) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralene thin film for XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
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