Localización del Locus Coeruleus en el cerebro de ratón
Summary
Locus coeruleus es un pequeño grupo de neuronas implicadas en una variedad de procesos fisiológicos. Aquí, describimos un protocolo para preparar secciones de cerebro de ratón para estudios de proteínas y metales en este núcleo.
Abstract
El locus coeruleus (LC) es un importante centro de norepinefrina produciendo neuronas que modulan varias funciones fisiológicas. Anormalidades estructurales o funcionales de LC afectan varias regiones del cerebro incluyendo la corteza, hipocampo y cerebelo y pueden contribuir a la depresión, trastorno bipolar, ansiedad, así como la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Estos trastornos a menudo se asocian a misbalance metal, pero el papel de los metales en LC se entiende solamente parcialmente. Estudios morfológicos y funcionales de LC son necesarios para comprender mejor las patologías humanas y la contribución de metales. Los ratones son un modelo experimental utilizado, pero el ratón LC es pequeño (~0.3 mm de diámetro) y difíciles de identificar para un no experto. Aquí, describimos un protocolo de inmunohistoquímica-base paso a paso para localizar la LC en el cerebro de ratón. Dopamina-β-hidroxilasa (DBH) y alternativamente, la tirosina hidroxilasa (TH), ambas enzimas altamente expresadas en la LC, se utilizan como marcadores inmunohistoquímicos en rebanadas de cerebro. Secciones adyacentes a las secciones que contiene la LC pueden utilizarse para su posterior análisis, incluyendo histología para estudios morfológicos, pruebas metabólicas, así como la proyección de imagen de metal por microscopía de fluorescencia de rayos x (XFM).
Introduction
El locus coeruleus (LC) es una región importante en el médula oblonga y un sitio importante de producción de norepinefrina (NE)1. La LC envía proyecciones a lo largo de los2 del cerebro a la corteza, el hipocampo y el cerebelo3 y regula procesos fisiológicos importantes, incluyendo el ritmo circadiano4,5, atención y memoria6, tensión de7,8de procesos cognitivos y emoción9,10. Disfunción de la LC ha sido implicada en trastornos neurológicos y neuropsiquiátricos11, incluyendo Parkinson enfermedad12,13,14, enfermedad de Alzheimer14, depresión15 ,16,17y18,de trastorno bipolar19ansiedad20,21,22,23, 24. teniendo en cuenta estas funciones, análisis de LC es fundamental para estudiar su función y disfunción.
Ratones son ampliamente utilizados para estudios de procesos fisiológicos y patofisiológicos. Debido a su pequeño tamaño, el ratón LC tiene un diámetro promedio de ~ 300 μm, conduciendo a la dificultad para ubicar la estructura. Durante secciones de la cerebral, la LC puede perderse fácilmente en secciones coronales o sagitales. Descripción identificación de LC en los animales los estudios disponibles no ofrecen un protocolo paso a paso que un no experto puede seguir1,25. Así, para ofrecer una orientación para la localización de la LC, se describe un protocolo que hemos desarrollado para localizar la región en el cerebro de ratón para aplicaciones varias (figura 1, figura 2, figura 3). El protocolo aplica a detección de seccionamiento e immunohistochemical cerebro cuidadosamente controladas de DAP26,27, o alternativamente TH24, ambas enzimas altamente enriquecidos en el LC28. Una vez que la LC se encuentra por immunohistochemistry, rebanadas del cerebro adyacente pueden utilizarse para otros estudios, los análisis morfológicos y metabólicos, así como estudios imagenológicos metal por rayos x fluorescencia microscopía (XFM)29. Describimos XFM como ejemplo en este protocolo (figura 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Orientar adecuadamente la muestra es un paso crucial en el presente Protocolo. Porque estamos usando características anatómicas de la superficie dorsal del cerebro para localizar LC (límite entre cerebelo y colículo inferior), es importante alinear correctamente las secciones. Esto requiere cuidado en fijar adecuadamente el cerebro en la matriz de máquina de cortar de cerebro de ratón. Recomendamos cortar ~ 500 μm más tejido anterior y posterior al LC para evitar la falta del núcleo. El error más común es cort…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Abigael Muchenditsi para el mantenimiento de la colonia de ratón. Uso de la fuente de fotones avanzado en el Laboratorio Nacional Argonne fue apoyado por el Departamento de energía de Estados Unidos, oficina de ciencia, oficina de energía ciencias básicas, con el número de contrato: DE-AC02-06CH11357. Agradecemos a Olga Antipova y Dr. Stefan Vogt para soporte a usuarios y asistencia en la fuente avanzada de fotones. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de salud beca 2R01GM101502 a SL.
Materials
| Adult mouse brain slicer matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source – donkey) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Charged glass slides | Genesee | 29-107 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Cryostat cutting blades | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Scissors Mini, 9.5cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – inhouse production (source – rabbit) | B. Eipper | – | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – commercially availabe (source – rabbit) | Cell Signaling | 8586 | |
| Falcon tubes, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
| Forane (isofluorane) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Forceps Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset mounting media | EM sciences | 17984-24 | |
| Microscope | Pascal | LSM 5 | |
| Multi-well plates, 24 wells | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Optimal cutting temperature compound (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Pencil brush | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Razor blades | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Spatulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T pins | Office Depot | 344615 | |
| The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (to prepare PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source – rabbit) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralene thin film for XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
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