אין ויוו יישוב ביטוי של חלבונים Optogenetic באמצעות סרטי משי/AAV
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה להעברת נגיפי ביטוי וקטורים למוח באמצעות סרטי משי fibroin. שיטה זו מאפשרת משלוח ממוקד של וקטורים ביטוי באמצעות סיבים אופטיים מצופים משי/AAV, סיבים אופטיים מחודדות וחלונות הגולגולת.
Abstract
המסע להבין את המעגלים העצביים כמה פרטי התהליך על מנת כונן התנהגות פלט בגילויים במידה רבה על ידי שיטות אופטי שפותחה לאחרונה עבור טיפול ומעקב אחר הפעילות של הנוירונים vivo בתוך. סוגים אלה של ניסויים מסתמכים על שני מרכיבים מרכזיים: 1) מושתלת מכשירים המספקים גישה אופטי אל המוח, וחלבונים 2) רגישים לאור משנה דעתנית עצביים או לספק readout פעילות. עצבית. ישנן מספר דרכים לבטא חלבונים רגישים לאור, אך הזרקת stereotaxic של וקטורים ויראלי היא כיום הגישה הגמישה ביותר כי הביטוי יכול להיות נשלט עם דיוק גנטי אנטומי, זמני. למרות השירות נהדר של וקטורים ויראלי, העברת הוירוס לאתר של שתלים אופטי מציבה אתגרים רבים. וירוס stereotaxic זריקות דורשים ניתוחים להגדיל את זמן הניתוח, להגדיל את העלות של מחקרים, ולא להוות סיכון לבריאות של החיה. הרקמה שמסביב, אליו יכול להיפגע פיזית על ידי המזרק הזרקה, ועל ידי immunogenic דלקת הנגרמת על ידי מסירה פתאומי של סיילין וירוס כייל גבוה. יישור זריקות עם שתלים אופטי הוא קשה במיוחד כאשר המיקוד אזורים קטנים עמוקים במוח. כדי להתגבר על האתגרים הללו, אנו מתארים שיטה ציפוי מספר סוגים של שתלים אופטי עם סרטים מורכב fibroin משי ווקטורים Adeno-הקשורים ויראלי (AAV). Fibroin, פולימר נגזר מן הגולם של טוואי המשי, ניתן לכמס להגן על מולקולות ואני יכול להיות מעובד לצורות ועד סרטים מסיסים קרמיקה. מושתל לתוך המוח, משי/AAV ציפויים שחרר וירוס על הממשק בין רכיבים אופטיים המוח שמסביב, נהיגה ביטוי בדיוק איפה הוא נחוץ. שיטה זו מתבצעת בקלות, ומבטיח להקל במידה רבה על ויוו מחקרים של מעגל עצבי פונקציה.
Introduction
בעשור האחרון יצר פיצוץ של חלבונים רגישים לאור מהונדסים עבור ניטור וטיפול פעילות עצבית1. וירוסים מציעים לו גמישות מרבית לביטוי כלים אלה optogenetic במוח. בהשוואה לבעלי חיים מהונדס, וירוסים הם הרבה יותר קל לייצר להעביר, לאחסן, המאפשר יישום מהיר של הכלים optogenetic החדש. ניתן לפלח ביטוי גנטי לאוכלוסיות עצביים שונים, וירוסים תוכנן עבור העברת רטרוגרדית ואפילו יכולה לשמש למטרה הביטוי מבוסס על קישוריות עצביים2.
הנגיפים מוחדרים בדרך כלל עם זריקות stereotaxic, אשר יכול להיות זמן רב ומאתגר. בדיוק פילוח אזורי קטן יכול להיות קשה, בזמן נהיגה ביטוי מעל אזורים רחבים לעיתים קרובות דורש זריקות רבות. יתר על כן, כאשר מכשיר אופטי לאחר מכן מושתל לתוך המוח כדי לספק אור ויוו, השתל חייב כראוי ליישר עם הזריקה ויראלי. כאן, אנו מתארים שיטה ליישם בקלות להעברת נגיפי וקטורים לרקמות מסביב התקן מושתל באמצעות סרטי משי fibroin3. Fibroin משי זמינים מסחרית, נסבל היטב על ידי רקמות עצביות, והוא יכול לשמש כדי לייצר חומרים עם מאפיינים מגוונים. סרטי משי שניתן להחיל על שתלים בעזרת ציוד מעבדה נפוץ כמו פיפטות microinjection או יד מדי סוכר. סרטי משי/AAV לחסל את הדרישה שני ניתוחים ולהבטיח כי הביטוי וירוס בתיווך מיושר כראוי השתל אופטי. הביטוי שנוצר מוגבלת עד הקצה של סיבים, ותוצאות פחות ביטוי לא רצויות לאורך המסלול סיבים מאשר זריקות stereotaxic.
בנוסף לייצור ביטוי יישוב בקצה של סיבים קטנים, סרטי משי/AAV יכול לשמש כדי לנהוג נרחבת (> בקוטר 3 מ מ) ביטוי קורטיקלית מתחת windows הגולגולת. In vivo פוטון 2 הדמיה של פעילות פלורסנט חיישנים הפך להיות כלי חיוני להעריך את התפקיד של פעילות. עצבית נהיגה עיבוד חושי קוגניטיבית. אולם, לנהוג אחיד הביטוי על פני שטחים נרחבים קורטיקלית, ניסויים לעיתים קרובות לבצע זריקות מרובות. זריקות אלה פקוקה מאוד והוא יכול להוביל ביטוי לא עקביים על-פני שדה הראייה. לעומת זאת, משי/AAV-מצופה חלונות הגולגולת הם מאוד קל לייצר, להפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש עבור ניתוחים, ולנסוע ביותר להפליא ביטוי מאות מיקרונים מתחת לפני השטח קורטיקלית.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש של משי/AAV למקד את הביטוי של חלבונים optogentic גוברת על המגבלות של גישות הנמצאים כיום בשימוש. למרות מחקרים רבים להשתמש בהצלחה AAV זריקות כדי להביע optogenetic חלבונים, זה מאתגר כדי ליישר את הביטוי עד הקצה של סיבים אופטיים באזורים סביב אורך סיבים ישרים, לאזור הצפייה של עדשה חיוך. בגלל חוסר התאמה ב…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות ג’יי וזקאוז לאיורים, קפלן ד ו ג Preda עבור ריאגנטים הדרכה מועילה, ואת המעבדות של ב’ סבאטיני והארווי ג עבור הדמיה ויוו . מיקרוסקופ התאפשרה על ידי מ Ocana ומרכז נוירוביולוגיה הדמיה, נתמך בחלקה על ידי המרכז לדימות העצבי כחלק של לאומי המכון של הפרעות נוירולוגיות ולהעניק מרכז הליבה P30 שבץ (NINDS) (NS072030). עבודה זו נתמכה על ידי קרן נבון Khodadad המשפחה, קרן ננסי לוריא סימני, ו על ידי מענקים NIH, NINDS R21NS093498, U01NS108177 ו- NINDS R35NS097284 כדי W.G.R, ועל ידי של NIH בתר F32NS101889 כדי C.H.C.
Materials
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
Riferimenti
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Tervo, D. G., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Jackman, S. L., et al. Silk Fibroin Films Facilitate Single-Step Targeted Expression of Optogenetic Proteins. Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (68), e50004 (2012).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (3), 194 (2007).
- Cao, Y., Wang, B. Biodegradation of silk biomaterials. International Journal of Molecular Sciences. 10 (4), 1514-1524 (2009).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nature Neuroscience. 13 (5), 584-591 (2010).
- Hines, D. J., Kaplan, D. L. Mechanisms of controlled release from silk fibroin films. Biomacromolecules. 12 (3), 804-812 (2011).
- Hu, X., et al. Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing. Biomacromolecules. 12 (5), 1686-1696 (2011).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophysical Journal. 97 (7), 2044-2050 (2009).
- Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation. Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).
- Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds. European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).
