Na Vivo Alvo expressão de proteínas de Optogenetic usando seda/AAV filmes
Summary
Aqui, apresentamos um método de distribuição de vetores de expressão viral no cérebro usando filmes de seda da fibroína. Esse método permite que o alvo entrega de vetores de expressão usando windows cranianas, cônico de fibras ópticas e fibras ópticas revestidas de seda/AAV.
Abstract
A busca da compreensão de circuitos neurais como informações do processo em ordem à saída comportamental de unidade tem sido grandemente ajudadas pela recentemente desenvolvidos métodos ópticos para manipular e monitorar a atividade de neurônios em vivo. Esses tipos de experiências dependem de dois componentes principais: 1) implantáveis dispositivos que fornecem acesso óptico para o cérebro e proteínas 2) sensíveis à luz que fornecem uma leitura da atividade neuronal ou alterar a excitabilidade neuronal. Há um número de maneiras de expressar proteínas sensíveis à luz, mas injeção estereotáxica de vetores virais é atualmente a abordagem mais flexível, porque a expressão pode ser controlado com precisão temporal, genética e anatômica. Apesar da grande utilidade de vetores virais, entregando o vírus para o site de implantes óptico poses inúmeros desafios. Injeções de vírus estereotáxica exigem cirurgias que aumentam o tempo cirúrgico, aumentam o custo dos estudos e representam um risco para a saúde do animal. O tecido circundante pode ser fisicamente danificado pela seringa de injeção e por imunogênica inflamação causada pela entrega abrupta de uma cápsula de alta concentração de vírus. Alinhar as injeções com implantes ópticos é especialmente difícil quando o direcionamento de pequenas regiões profundas no cérebro. Para superar estes desafios, nós descrevemos um método para revestir vários tipos de implantes ópticos com filmes compostos de seda da fibroína e Adeno-associado vetores virais de (AAV). Fibroin, um polímero derivado de Bombyx mori, o casulo pode encapsular e proteger biomoléculas e podem ser transformadas em formas que variam de filmes solúveis a cerâmica. Quando implantado no cérebro, revestimentos de seda/AAV liberar o vírus na interface entre os elementos de óptica e o cérebro circundante, dirigindo a expressão precisamente onde é necessário. Este método é facilmente implementado e promete facilitar grandemente na vivo estudos da função do circuito neural.
Introduction
Na última década tem produzido uma explosão de engenharia proteínas sensíveis à luz para monitoramento e manipulação neural atividade1. Vírus para oferecer incomparável flexibilidade para expressar essas ferramentas optogenetic no cérebro. Em comparação com animais transgénicos, vírus são muito mais fáceis de produzir, transportar e armazenar, permitindo a rápida implementação das ferramentas do mais novos optogenetic. Expressão pode ser alvo geneticamente distintas populações neuronal, e vírus projetados para o transporte retrógrado ainda podem ser usados para direcionar a expressão baseada na conectividade neuronal2.
Vírus são normalmente introduzidas com injeções estereotáxicos, que podem ser demorado e desafiador. Precisamente como alvo pequenas regiões pode ser difícil, enquanto expressão de condução sobre grandes áreas muitas vezes requer muitas injeções. Além disso, quando um dispositivo óptico é posteriormente implantado no cérebro para fornecer luz na vivo, o implante deve ser alinhado com a injeção de viral. Aqui, descrevemos um método facilmente implementados para a entrega de vetores virais para o tecido em torno de um dispositivo implantado usando seda da fibroína filmes3. Fibroin seda é bem tolerado pelos tecidos neurais, comercialmente disponível e pode ser usado para produzir materiais com propriedades variadas. Filmes de seda podem ser aplicadas aos implantes utilizando equipamentos comuns de laboratório como pipetas microinjeção ou pipetas de mão. Filmes de seda/AAV eliminam a exigência de dois procedimentos cirúrgicos e garantir que a expressão mediada por vírus está corretamente alinhado ao implante óptico. A expressão resultante é restrito à ponta das fibras e resulta em menos expressão indesejado ao longo da trilha de fibra do que injeções estereotáxicos.
Além de produzir alvo expressão na ponta de pequenas fibras, filmes de seda/AAV podem ser usados para conduzir generalizada (> 3 mm de diâmetro) expressão cortical sob windows cranianas. Na vivo imagem 2-fóton de sensores fluorescente atividade tornou-se uma ferramenta indispensável para avaliar o papel da atividade neuronal na condução do processamento sensorial e cognitivo. No entanto, para conduzir uniforme expressão sobre as áreas corticais amplas, experimentadores frequentemente executar múltiplas injeções. Essas injeções podem ser extremamente demoradas e podem levar a expressão inconsistente do outro lado do campo de visão. Em contraste, seda/AAV-revestido cranianas windows são extremamente fáceis de fabricar, reduzir significativamente o tempo necessário para cirurgias e dirigir mais notavelmente a expressão centenas de micra abaixo da superfície cortical.
Protocol
Representative Results
Discussion
O uso de seda/AAV para atingir a expressão de proteínas optogentic supera as limitações das abordagens que estão atualmente em uso. Embora muitos estudos com sucesso usam injeções de AAV para expressar proteínas optogenetic, é desafiador para alinhar a expressão para a dica de fibras ópticas, para regiões de todo o comprimento das fibras afiladas e à região de visualização de uma lente de sorriso. Por causa do desalinhamento entre componentes ópticos e optogenetic expressão, estereotáxicos injeções p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam agradecer J. Vazquez para ilustrações, d. Kaplan e C. Preda para reagentes e orientação útil e os laboratórios de Sabatini B. e C. Harvey para a imagem latente na vivo . A microscopia foi viabilizada pela M. Ocana e do centro de imagiologia de neurobiologia, apoiada em parte pelo centro de imagem Neural como parte de um nacional Instituto de doenças neurológicas e Stroke (NINDS) P30 núcleo centro conceder (NS072030). Este trabalho foi financiado pela Fundação da família de Khodadad GVR, Fundação Nancy Lurie marcas e por concessões do NIH, NINDS R21NS093498, U01NS108177 e R35NS097284 de NINDS para W.G.R e por uma comunhão de pós-doutorado de NIH F32NS101889 para C.H.C.
Materials
| Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
| Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
| Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
| Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
| Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
| Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
| Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
| Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
| Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
| Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
| GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
| Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
| Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
Riferimenti
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Tervo, D. G., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Jackman, S. L., et al. Silk Fibroin Films Facilitate Single-Step Targeted Expression of Optogenetic Proteins. Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (68), e50004 (2012).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2011).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin sectioning of slice preparations for immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (3), 194 (2007).
- Cao, Y., Wang, B. Biodegradation of silk biomaterials. International Journal of Molecular Sciences. 10 (4), 1514-1524 (2009).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
- Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nature Neuroscience. 13 (5), 584-591 (2010).
- Hines, D. J., Kaplan, D. L. Mechanisms of controlled release from silk fibroin films. Biomacromolecules. 12 (3), 804-812 (2011).
- Hu, X., et al. Regulation of silk material structure by temperature-controlled water vapor annealing. Biomacromolecules. 12 (5), 1686-1696 (2011).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Yucel, T., Cebe, P., Kaplan, D. L. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophysical Journal. 97 (7), 2044-2050 (2009).
- Wang, X., Kluge, J. A., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. Sonication-induced gelation of silk fibroin for cell encapsulation. Biomaterials. 29 (8), 1054-1064 (2008).
- Lee, J., Park, S. H., Seo, I. H., Lee, K. J., Ryu, W. Rapid and repeatable fabrication of high A/R silk fibroin microneedles using thermally-drawn micromolds. European Journal of Biopharmaceutics. 94, 11-19 (2015).
