माउस का आकलन करने के लिए बढ़ाया ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन-व्यक्त ई कोलाई का उपयोग पेरिटोनियल मैक्रोफेज Phagocytosis
Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल मौजूद माउस का आकलन करने के लिए पेरिटोनियल मैक्रोफेज phagocytosis का उपयोग कर बढ़ाया ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन-व्यक्त ई कोलाई।
Abstract
इस पांडुलिपि एक सरल और reproducible विधि का वर्णन करने के लिए एक phagocytosis परख प्रदर्शन । इस विधि के पहले भाग में एक पालतू-सूमो-EGFP वेक्टर (सूमो = छोटे ubiquitin-जैसे संशोधक) का निर्माण और ई कोलाई (BL21DE) में संवर्धित हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (EGFP) व्यक्त करना शामिल है । EGFP-व्यक्त ई. कोलाई ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए मैक्रोफेज के साथ coincubated है; नकारात्मक नियंत्रण समूह बर्फ पर समय की एक ही राशि के लिए मशीन है । फिर, मैक्रोफेज आकलन के लिए तैयार हैं । इस तकनीक के फायदों में इसके सरल और सीधा कदम शामिल हैं, और phagocytosis को दोनों फ्लो cytometer और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप से मापा जा सकता है । EGFP-व्यक्त ई. कोलाई स्थिर है और एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत प्रदर्शन के बाद भी मैक्रोफेज paraformaldehyde के साथ तय कर रहे हैं । यह विधि न केवल मैक्रोफेज सेल लाइनों या इन विट्रो में प्राथमिक मैक्रोफेज के आकलन के लिए उपयुक्त है बल्कि परिधीय रक्त phagocytosis कोशिकाओं में granulocyte और monocyte mononuclear के मूल्यांकन के लिए भी उपयुक्त है । परिणाम बताते हैं कि युवा (आठ सप्ताहीय) चूहों से पेरिटोनियल मैक्रोफेज की phagocytic क्षमता वृद्ध (१६ माह की उम्र वाले) चूहों से मैक्रोफेज की तुलना में अधिक है. संक्षेप में, इस विधि मैक्रोफेज phagocytosis उपायों और सहज प्रतिरक्षा प्रणाली समारोह का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है ।
Introduction
मैक्रोफेज phagocytosis परख अक्सर जन्मजात प्रतिरक्षा समारोह का अध्ययन किया जाता है । जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया संक्रमण के लिए संवेदनशीलता का संकेत हो सकता है । मैक्रोफेज सेल लाइनों इम्यूनोलॉजी अध्ययन में व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है । हालांकि, विस्तारित पारित होने के कारण जीन हानि और समझौता प्रतिरक्षा कार्य इन सेल लाइनों में हो सकता है । इस प्रकार, प्राथमिक पेरिटोनियल मैक्रोफेज आदर्श वस्तु है जिसमें सेल समारोह1का अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं ।
हालांकि जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए वृद्ध शरीर में बरकरार सोचा था, phagocytic क्षमता कम हो सकती है कि छोटे शरीर2,3में की तुलना में । यहां, हम युवा (आठ से पेरिटोनियल मैक्रोफेज के phagocytosis का आकलन करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन करेंगे सप्ताह पुराने) और आयु वर्ग (16 महीने पुराने) माउस का उपयोग EGFP-व्यक्त ई. कोलाई, जो सुविधाजनक, जल्दी है, और आर्थिक रूप से संभव है ।
एक EGFP-व्यक्त ई. कोलाई तनाव का उपयोग इस परख के लाभों में से एक है क्योंकि इन बैक्टीरिया स्थिर है और एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत प्रदर्शित कर रहे हैं, के बाद भी मैक्रोफेज द्वारा तय कर रहे है 4% (w/ इसके अतिरिक्त, EGFP-व्यक्त ई. कोलाईका उपयोग करके, शोधकर्ताओं आगे phagocytosis, जो समय बचाता है के बाद दाग की जरूरत नहीं है । इसके अलावा, मैक्रोफेज ई. कोलाई सतह प्रतिजन के लिए immunoresponsive रहे हैं, ई. कोलाई अधिक phagocytosis परख के लिए EGFP-व्यक्त कवक या fluorescein-लेबल मोतियों का उपयोग करने से उपयुक्त बना ।
साथ EGFP-व्यक्त ई. कोलाई, एक phagocytosis परख आसानी से 2 ज में पूरा किया जा सकता है और दोनों प्रवाह cytometry और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा, शोधकर्ता के उद्देश्य पर निर्भर करता है । चूंकि यह विधि सीधे phagocytic की क्षमता का उपाय है, परिणाम अंय अप्रत्यक्ष तरीकों की तुलना में अधिक reproducible हैं ।
यह विधि एक कच्ची 264.7 सेल लाइन और मानव परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं4में भी मान्य किया गया है । नीचे दिए गए पाठ इस परख प्रदर्शन के लिए विस्तृत कदम दर कदम निर्देश प्रदान करता है और महत्वपूर्ण कदम है कि शोधकर्ताओं को अपने प्रयोगों की जरूरतों को पूरा संशोधित कर सकते है पर प्रकाश डाला गया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में कदम काफी सरल और सीधा कर रहे हैं । एक महत्वपूर्ण कदम के लिए ई. कोलाईपर EGFP अभिव्यक्ति प्रेरित है । आमतौर पर, जब eukaryotes से एक जीन, EGFP की तरह, ई. कोलाईकी तरह prokaryotes में व्यक्त करने की योजना बनाई ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
चीन की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (सं. ३१८०००४६) और लियाओनिंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (सं. २०१७०५४०२६२) ने इस काम का समर्थन किया । यह काम डालियां मेडिकल यूनिवर्सिटी के दूसरे अस्पताल में वैज्ञानिक अनुसंधान केंद्र की प्रयोगशालाओं में निपुण था. लेखक जिओ-लिन धंयवाद करना चाहते है प्रवाह cytometry के साथ उसकी सहायता के लिए गाया था, और बो Qu और दांग-छुअन यांग वीडियो उत्पादन में उनकी सहायता के लिए ।
Materials
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | – | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | – | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | – | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
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