Yeşil floresans Protein-ifade gelişmiş kullanma fare Peritoneal makrofaj fagositoz değerlendirmek için Escherichia Coli
Summary
Burada, fare peritoneal makrofaj fagositoz gelişmiş yeşil floresans Escherichia coliprotein ifade kullanarak değerlendirmek için bir protokol mevcut.
Abstract
Bu el yazması fagositoz tahlil gerçekleştirmek için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem açıklanır. Bu yöntem ilk bölümünde bir evde beslenen hayvan-SUMO-EGFP vektör yapı içerir (SUMO küçük Ubikuitin benzeri değiştirici =) ve ifade gelişmiş yeşil floresans protein Escherichia coli (BL21DE) (EGFP). E. coli EGFP ifade ile makrofajlar 37 ° C’de 1 h için coincubated; negatif kontrol grubu aynı süre için buza inkübe. O zaman, makrofajlar değerlendirmesi için hazırsınız demektir. Bu teknik avantajları, basit ve kolay adımlar içerir ve fagositoz her iki akış sitometresi ve floresan mikroskop tarafından ölçülebilir. EGFP ifade E. coli stabildir ve sonra bile makrofajlar paraformaldehyde ile giderilen bir güçlü floresans sinyal görüntüler. Bu yöntem yalnızca makrofaj hücre hatları veya birincil makrofajlar in vitro olarak değerlendirilmesi için uygun ama ayrıca periferik kan mononükleer hücrelerinde granülosit ve monosit fagositoz değerlendirilmesi için uygun değildir. Sonuçları genç (sekiz-hafta-yaşlı) fareler gelen periton makrofajlar fagositik kapasitesini makrofajlar yaşında (16-ay-yaşlı) fareler dan daha yüksek olduğunu gösteriyor. Özet olarak, bu yöntem makrofaj fagositoz ölçer ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi işlevi çalışmak için uygundur.
Introduction
Makrofaj fagositoz deneyleri genellikle doğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu incelemek için kullanılır. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı enfeksiyon duyarlılık gösterebilir. Makrofaj hücre satırları İmmünoloji çalışmalarda yaygın olarak kullanılır. Ancak, genişletilmiş geçit gen kaybına neden olabilir ve bu hücre satırları bağışıklık fonksiyonlarında tehlikeye. Böylece, birincil periton makrofaj hücre işlevi1eğitim ideal nesneyi vardır.
Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı yaşlı gövdesine sağlam olduğu düşünülüyordu rağmen fagositik yeteneği ile karşılaştırıldığında daha genç içinde2,3vücut düşebilir. Burada, biz genç (sekiz-hafta-yaşlı) ve uygun, hızlı ve ekonomik olarak mümkün olan EGFP ifade E. coli, kullanarak (16-ay-yaşlı) yaşlı fare peritoneal makrofajlar fagositoz değerlendirmek için bir yöntem gösterecektir.
Çünkü bu bakterilerin stabildir ve sonra bile makrofajlar %4 (w/v) paraformaldehyde tarafından giderilen bir güçlü floresans sinyal görüntülemek bir EGFP ifade e.coli suşu kullanımı bu tahlil avantajlarından biridir. Ayrıca, E. coliEGFP ifade kullanarak, araştırmacılar gerek yok daha fazla zaman kazandırır fagositoz sonra boyama. Ayrıca, makrofajlar immunoresponsive E. coli yüzey antijeni, E. coli EGFP ifade mantarlar veya floresein etiketli boncuk kullanarak daha fagositoz tahlil için daha uygun yapmak için vardır.
EGFP ifade E. coliile fagositoz tahlil kolayca 2 h başarılı ve her iki akış sitometresi ve floresan mikroskopisi, araştırmacı amaca bağlı olarak tarafından ölçülür. Bu yöntem, doğrudan fagositik yeteneğini ölçer beri daha dolaylı diğer yöntemlerden daha tekrarlanabilir sonuçlarıdır.
Bu yöntem aynı zamanda bir RAW264.7 hücre kültürünü doğrulandı ve4insan periferik kan mononükleer hücreler. Aşağıdaki metin bu tahlil gerçekleştirmek için ayrıntılı adım adım yönergeler sağlar ve araştırmacılar deneyleri ihtiyaçlarını karşılamak üzere değiştirebilecek kritik adımlar vurgular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı adımda oldukça basit ve anlaşılır. Bir kritik adım E. coliEGFP ifade teşvik etmektir. Genellikle, bir gen Ökaryotlar, EGFP gibi gelen prokaryot E.coli olarak ifade etmek için planlanan tarihte protein’ın doğal yapısı ve faaliyet değişiklikleri protein etkin olmayan toplamları (dahil organları), oluşturacak bir risk olduğunu. Evde beslenen hayvan-SUMO vektör kullanarak ve evde beslenen hayvan-SUMO-EGFP plazmid oluşturmak yoluyla, EGFP-SUMO füzyon protein başar?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser desteklenen Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (no. 31800046) ve Liaoning Eyaleti doğal Bilim Vakfı (no. 20170540262). Bu eser, ikinci hastane Dalian Tıp Üniversitesi Bilimsel Araştırma Merkezi laboratuarlarında başarılı oldu. Yazarlar Xiao-Lin Sang akış sitometresi ile yardımını ve Bo Qu ve Dong-Chuan Yang video üretiminde onların yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | – | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | – | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | – | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
References
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
