Micronization מכני של Lipoaspirates לטיפול רגנרטיבית
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשיג סטרומה השבר בכלי הדם של רקמת שומן באמצעות סדרה של תהליכים מכניים, הכוללים תחליב centrifugations מרובים.
Abstract
השבר בכלי הדם סטרומה (SVF) הפך להיות כלי משובי עבור מחלות שונות; עם זאת, החקיקה מסדיר בקפדנות היישום הקליני של התא מוצרים באמצעות collagenase. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי ליצור תערובת להזרקה של תאים SVF מטריצה חוץ-תאית מקורי מתוך רקמת שומן על ידי תהליך מכאנית בלבד. Lipoaspirates הם הכניסו לתוך צנטריפוגה, ויצא ב x 1,200 g למשך 3 דקות. השכבה האמצעית שנאספו, הפרדתו בשתי שכבות (צפיפות גבוהה שומן בחלק התחתון) ושומן בצפיפות נמוכה בחלק העליון. השכבה העליונה היא ישירות emulsified על ידי העברת intersyringe, בקצב של 20 מ”ל/s עבור x 6 8 x. השומן emulsified הוא centrifuged ב x 2,000 g למשך 3 דקות, ואת החומר דביק מתחת לשכבת הנפט ונשתמש כהגדרתו של מטריצה חוץ-תאית (ECM) / SVF-ג’ל. השמן על השכבה העליונה נאסף. כ- 5 מ ל שמן להוסיף 15 מ”ל של שומן בצפיפות גבוהה, emulsified על ידי העברת intersyringe, בקצב של 20 מ”ל/s עבור x 6 8 x. השומן emulsified הוא centrifuged ב x 2,000 g למשך 3 דקות, והוא החומר הדביק גם ECM/SVF-ג’ל. לאחר ההשתלה של ECM/SVF-הג’ל לתוך עכברים עירום, השתל שנקטפו, מוערך על ידי בדיקה היסטולוגית. התוצאה מראה כי המוצר הזה יש פוטנציאל להתחדש לתוך רקמת שומן רגילה. ההליך זה הליך פשוט, יעיל דיסוציאציה מכני לתמצת את התאים SVF נעוץ ECM תומכת הטבעי שלהם למטרות משובי.
Introduction
תא גזע טיפולים מספקים שינוי פרדיגמה רקמות תיקון והתחדשות כך הם עשויים להציע של משטר טיפולי חלופיים עבור מחלות שונות1. תאי גזע (למשל, גזע pluripotent המושרה, תאי גזע עובריים) הפוטנציאל הטיפולי נהדר אבל הם מוגבל בשל תא ושיקולים אתיים. שומן-derived mesenchymal סטרומה/תאי גזע (השיקופיים) הם קל להשיג lipoaspirates, שאינם כפופים למגבלות זהות; לכן, זה הפך מסוג תאים אידיאלי עבור רפואה רגנרטיבית מעשי2. בנוסף, הם הינם nonimmunogenic וכוללים שפע המשאבים השומן autologous3.
כיום, השיקופיים מתקבלים בעיקר על ידי בתיווך collagenase עיכול של רקמת שומן. השבר בכלי הדם סטרומה (SVF) של רקמת שומן מכיל השיקופיים, תאים ובתאים אנדותל, pericytes של תאים חיסוניים. למרות קבלת צפיפות גבוהה של SVF/השיקופיים enzymatically הראו שיש השפעות מועילות, החקיקה במספר מדינות מסדיר בקפדנות את היישום הקליני של מוצרים מבוססי תאים באמצעות collagenase4. לעכל את רקמת שומן עם collagenase למשך 30 דקות כדי 1 h כדי להשיג SVF התאים, מגביר את הסיכון של שני חומרים אקסוגניים הכנה, המתפללים. התרבות חסיד הטיהור של השיקופיים, אשר לוקח ימים עד שבועות, דורשים ציוד מעבדה ספציפי. יתר על כן, רוב המחקרים, SVF תאים, השיקופיים משמשים ההשעיה. בלי ההגנה של מטריצה חוץ-תאית (ECM) או נושא אחר, תאים פנויים פגיעים, לגרום השמירה תא המסכן לאחר ההזרקה, לסכן את התוצאה הטיפולית5. מכל הסיבות הללו להגביל יישום נוסף של טיפול בתאי גזע.
להשיג השיקופיים של רקמת שומן ללא עיכול בתיווך collagenase, מספר הליכים עיבוד מכניים, כולל צנטריפוגה, מכני קוצץ, גיזום, pureeing, הא, היה מפותח6,7 , 8 , 9. שיטות אלה נחשבים לדחוס רקמת ו השיקופיים ע י מכנית שיבוש adipocytes בוגרת ושלפוחיות שלהם המכילים שמן. יתר על כן, ההכנות הללו, המכיל ריכוז גבוה של השיקופיים, הראה פוטנציאל טיפולי רב כמו רפואה רגנרטיבית של בעל חיים מודלים8,9,10.
בשנת 2013, Tonnard. et al. הציג את nanofat הרכבה טכניקה, אשר כרוך בהפקת emulsified lipoaspirates על ידי intersyringe עיבוד11. הטיית הכוח שנוצר על-ידי intersyringe הסטה יכול לשבור באופן סלקטיבי adipocytes בוגרת. בהתבסס על הממצאים שלהם, פיתחנו שיטת עיבוד מכניים גרידא מסירה את רוב השומנים נוזל, lipoaspirates משאיר רק SVF תאים, ECM fractionated, אשר הוא ECM/SVF-ג’ל12. במסמך זה, אנו מתארים את הפרטים של תהליך מכני של האדם, נגזר רקמת שומן כדי לייצר את ה-ECM/SVF-הג’ל.
Protocol
Representative Results
Discussion
טיפול משובי מבוססי תאי גזע הראה תועלת פוטנציאלית רבה במחלות שונות. השיקופיים הם מועמדים בולטים טיפולית כי הם קלים להשיג ואת יש יכולת התחדשות רקמות הרומן15ותיקון של רקמות. עם זאת, קיימות מגבלות להרחיב את היישום הקליני שלה, מכיוון שהיא דורשת פרוצדורות מסובכות לבודד תאים, collagenase ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81471881, 81601702, 81671931), קרן מדעי הטבע של גואנג-דונג פרובינציה של סין (2014A030310155), מנהל קרן של Nanfang החולים (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).
Materials
| Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 | Molecular Probes | I21411 | |
| guinea pig anti-mouse perilipin | Progen | GP29 | |
| DAPI | Thermofisher | D1306 | |
| wide tip pipet | Celltreat | 229211B | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP2 | |
| nude nice | Southern Mdical University | / | |
| light microscope | Olympus | / | |
| 50 mL tube | Cornig | 430828 | |
| sterile bag | Laishi | / | |
| microtome | Leica | CM1900 | |
| centrifuge | Heraus |
Riferimenti
- Bateman, M. E., et al. Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. , 812693 (2012).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).
- Halme, D. G., Kessler, D. A. FDA regulation of stem-cell-based therapies. New England Journal of Medicine. 355 (16), 1730-1735 (2006).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
- van Dongen, J. A., et al. The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes. Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).
- Mashiko, T., et al. Mechanical Micronization of Lipoaspirates: Squeeze and Emulsification Techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (1), 79-90 (2017).
- Feng, J., et al. Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer. Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).
- Zhang, P., et al. Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product – stromal vascular fraction gel. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).
- Tonnard, P., et al. Nanofat grafting: basic research and clinical applications. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).
- Yao, Y., et al. Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).
- Yao, Y., et al. Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation. Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).
- Zhang, Y., et al. Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).
- Sun, B., et al. Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases. Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).
- Allen, R. J., et al. Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).
- Qiu, L., et al. Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).
