Aqui, apresentamos um protocolo para obter a fração vascular do estroma do tecido adiposo através de uma série de processos mecânicos, que incluem emulsificação e múltiplas centrifugações.
Fração de vascular do estroma (SVF) tornou-se uma ferramenta regenerativa para várias doenças; no entanto, a legislação estritamente regula a aplicação clínica dos produtos de célula usando a colagenase. Aqui, apresentamos um protocolo para gerar uma mistura injectável de células SVF e nativo da matriz extracelular do tecido adiposo, por um processo puramente mecânico. Lipoaspirates são colocar em uma centrífuga e girou a 1.200 x g durante 3 min. A camada média é coletada e separada em duas camadas (alta densidade de gordura na parte inferior) e baixa densidade de gordura na parte superior. A camada superior é diretamente emulsionada deslocando-se intersyringe, a uma taxa de 20 mL/s para 6 x 8 x. A gordura emulsionada é centrifugada a 2.000 x g durante 3 min, e a substância pegajosa sob a camada de óleo é coletada e definida como a matriz extracelular (ECM) / SVF-gel. O óleo sobre a camada superior é coletado. Cerca de 5 mL de óleo é adicionado à 15 mL de gordura de alta densidade e emulsionado deslocando-se intersyringe, a uma taxa de 20 mL/s para 6 x 8 x. A gordura emulsionada é centrifugada a 2.000 x g durante 3 min, e a substância pegajosa é também ECM/SVF-gel. Após o transplante do ECM/SVF-gel em camundongos, o enxerto é colhido e avaliado através do exame histológico. O resultado mostra que este produto tem o potencial para se regenerar em tecido adiposo normal. Este procedimento é um procedimento de dissociação mecânica simples, eficaz para condensar as células SVF incorporadas em sua natural apoio ECM para fins regenerativos.
Terapias de células-tronco fornecem uma mudança de paradigma para a regeneração e reparação tecidual para que eles possam oferecer um regime terapêutico alternativo para várias doenças1. Células-tronco (por exemplo, as células-tronco pluripotentes induzidas e células-tronco embrionárias) têm um grande potencial terapêutico, mas são limitadas devido ao regulamento de célula e considerações éticas. Adiposo-derivados mesenquimais estromais/células-tronco (ASCs) são fáceis de obter do lipoaspirates e não sujeitos às mesmas restrições; assim, tornou-se um tipo de célula ideal para medicina regenerativa prática2. Além disso, eles são nonimmunogenic e têm recursos abundantes de gordura autóloga3.
Atualmente, ASCs são obtidos principalmente por mediada por colagenase digestão do tecido adiposo. A fração vascular do estroma (SVF) do tecido adiposo contém células progenitoras endoteliais ASCs, pericitos e células do sistema imunológico. Embora a obtenção de uma elevada densidade de SVF/ASCs enzimaticamente foi mostrado para ter efeitos benéficos, a legislação em vários países estritamente regula a aplicação clínica dos produtos à base de célula usando colagenase4. Digerir o tecido adiposo com colagenase por 30 min a 1 h para obter as células SVF aumenta o risco de ambos material exógeno na preparação e contaminação biológica. A cultura aderente e a purificação de ASCs, que leva dias para semanas, exigem equipamentos laboratoriais específicos. Além disso, na maioria dos estudos, células SVF e ASCs são usados em suspensão. Sem a proteção da matriz extracelular (ECM) ou outra transportadora, células livres são vulneráveis, causar uma retenção de pobre célula após a injeção e comprometer o resultado terapêutico de5. Todas estas razões limitam a aplicação adicional de terapia com células tronco.
Para obter o ASCs do tecido adiposo sem digestão mediada por colagenase, vários procedimentos de processamento mecânico, incluindo a centrifugação, mecânica, picar, ralar, reduzir a puré e picagem, têm sido desenvolvidos6,7 , 8 , 9. esses métodos são pensados para condensar o tecido e ASCs por perturbar mecanicamente adipócitos maduros e suas vesículas contendo óleo. Além disso, estas preparações, contendo altas concentrações de ASCs, mostraram considerável potencial terapêutico como medicina regenerativa em animal modelos8,9,10.
Em 2013, et al . Tonnard introduziu o nanofat enxertia técnica, que envolve produzindo emulsionado lipoaspirates por intersyringe11de processamento. A força de corte criada por intersyringe deslocando seletivamente pode quebrar adipócitos maduros. Baseado em seus findings, desenvolvemos um método de processamento puramente mecânico que remove a maioria dos lipídios e fluido no lipoaspirates, deixando apenas as células SVF e ECM fracionada, o que é ECM/SVF-gel12. Aqui, descrevemos os detalhes do processo mecânico de humanos-derivadas de tecido adiposo para produzir o ECM/SVF-gel.
Terapia regenerativa baseada em células-tronco tem mostrado um grande benefício potencial em diferentes doenças. ASCs são excelentes candidatos terapêuticos porque eles são fáceis de obter e ter a capacidade de reparação tecidual e a regeneração de novos tecidos15. No entanto, existem limitações para expandir sua aplicação clínica, pois requer procedimentos complicados para isolar as células e colagenase para processamento6. Assim, é essencial desenvolver …
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciência natural da China (81471881, 81601702, 81671931), a Fundação de ciências naturais da província de Guangdong de China (2014A030310155) e a Fundação administrador de Hospital Nanfang (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).
Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 | Molecular Probes | I21411 | |
guinea pig anti-mouse perilipin | Progen | GP29 | |
DAPI | Thermofisher | D1306 | |
wide tip pipet | Celltreat | 229211B | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP2 | |
nude nice | Southern Mdical University | / | |
light microscope | Olympus | / | |
50 mL tube | Cornig | 430828 | |
sterile bag | Laishi | / | |
microtome | Leica | CM1900 | |
centrifuge | Heraus |