Мультиплексирование сосредоточены УЗИ стимуляции с микроскопии флуоресцирования
Summary
Низкоинтенсивного импульсного УЗИ стимуляции (LIPUS)-это механизм для неинвазивной механической стимуляции эндогенной или инженерии клетки с высоким пространственным и временным разрешением. Эта статья описывает, как реализовать LIPUS epi флуоресцентным микроскопом и как минимизировать акустическая разночтений по УЗИ пути для предотвращения нежелательных механические артефакты.
Abstract
Сосредоточив ультразвук малой интенсивности импульсов, которые проникают мягких тканей, LIPUS представляет перспективных биомедицинских технологий удаленно и безопасно управлять нервных стрельбы, гормональной секреции и генетически перепрограммировать клетки. Однако перевод этой технологии для медицинских применений в настоящее время сдерживается отсутствием биофизических механизмов, с помощью которого направлены тканей чувство и реагировать на LIPUS. Подходящие подход для выявления этих механизмов будет использовать оптические биодатчики в сочетании с LIPUS для определения, лежащие в основе сигнальных путей. Однако реализация LIPUS флуоресцентным микроскопом может ввести нежелательных механических артефактов вследствие наличия физических интерфейсов, которые отражают, поглощать и преломляют Акустические волны. Эта статья представляет пошаговую процедуру для включения LIPUS имеющиеся вертикально epi флуоресценции Микроскопы минимизируя влияние физических интерфейсов для акустических пути. Простая процедура описана работать один элемент ультразвукового датчика и довести зоне фокуса преобразователя в объективных координационным центром. Использование LIPUS иллюстрируется примером транзиентов LIPUS-индуцированной кальция в клетки культивировали глиобластомы человека измеряется с помощью кальция изображений.
Introduction
Многие заболевания требуют некоторые формы инвазивных медицинского вмешательства. Эти процедуры часто дорогие, рискованно, требуют восстановления периоды и таким образом добавить бремя для систем здравоохранения. Неинвазивная терапевтические механизмы имеют потенциал для обеспечения альтернатив безопаснее и дешевле обычных хирургических процедур. Однако текущий неинвазивные подходов, таких как фармакотерапии или транскраниальная магнитная стимуляция часто ограничены компромиссов между ткани проникновения, пространственно-временных резолюции и нежелательных эффектов пробить. В этом контексте фокусированного ультразвука является перспективной технологии неинвазивные с потенциалом для манипулирования биологических функций глубоко внутри ткани с высокой точностью пространственно-временных и ограниченных пробить эффектов.
Фокусированный ультразвук разрушает стимуляции состоит из доставки акустической энергии в точных местах глубоко внутри живых организмов. В зависимости от параметров акустических импульсов эта энергия может иметь множество медицинских применений. Например пищевых продуктов и медикаментов одобрил использование высокой интенсивности ультразвука направлены (HiFU) на тепловой аблация опухолей предстательной железы, вызывая дрожь мозга регионов, миома матки и вызывая боли нервных окончаний в костных метастазов1 . Кавитация при посредничестве HiFu СРТ используется также для временно открыть blood – brain барьер для целенаправленной доставки системно ведении терапии2. Пульс средняя интенсивность пространственных пик (яАЮП) и пространственных пик височной средняя интенсивность (яЗИП) используется для HiFU приложений, как правило, выше несколько кВт см-2 и производят пульсовое давление несколько десятков МПа. Эти значения интенсивности являются намного выше FDA утвержденных яАЮП и яЗИП ограничения для ультразвуковой диагностики, 190 W см-2 и 720 МВт см-2, соответственно3. Напротив недавние исследования показали что неразрушающего импульсных ультразвуковых стимуляции, которые находятся в пределах или вблизи предела ограничения интенсивности ультразвуковой диагностики (LIPUS) может быть эффективным удаленно и безопасно управлять нейронных стрельбы4, 5,6,7,8, гормональной секреции9,10 и биоинженерных клеток11. Тем не менее клеточном и молекулярном механизмы, в которых клетки воспринимают и отвечают к УЗИ остаются неясными, исключающие клинический перевод LIPUS. Таким образом за последние несколько лет, исследования искусственных оболочек, культивируемых клеток и животных стимулируется с УЗИ получили импульс раскрыть биофизических и физиологических процессов модулированные LIPUS12,13, 14,15.
Звук состоит из колебаний, распространяющихся через физический носитель. УЗИ является звук с частотой выше человека слышимого диапазона (то есть, выше 20 кГц). В лабораторных условиях, ультразвуковые волны обычно производятся пьезоэлектрические преобразователи, которые содержат материал, который вибрирует в ответ на колеблющиеся в конкретной полосы пропускания высокой частоты электрического поля. Существует два типа датчиков: совмещенные преобразователи и датчики массивы. Единственный элемент пьезоэлектрические преобразователи имеют изогнутые поверхности, которая действует как фокусирующей линзы и следовательно концентратов акустической энергии в определенную область под названием зоне фокуса. Одноэлементные преобразователи намного дешевле и легче работать, чем массивы датчика. Эта статья будет сосредоточена на одноэлементных преобразователей.
Размер фокуса зоны целенаправленной один элемент датчика зависит от геометрических свойств акустические линзы и акустические частоты. Для достижения миллиметр размер зоны фокуса с одного элемента датчика, обычно требуются ультразвуковые частоты в диапазоне МГц. К сожалению акустических волн на такой частоте являются очень быстро ослабленного при распространении в разреженной среды как воздух. Таким образом МГц ультразвуковые волны необходимо создаются и распространяются на образец в плотный материал, например воды. Это является первой задачей в деле интеграции механизма LIPUS микроскопом.
Вторая задача заключается в минимизации физические интерфейсы между материалами с различных акустических импедансов, (который является продуктом плотности материала и акустическая скорость) вдоль акустического пути. Эти интерфейсы могут отражать, преломляют, точечной и поглощать акустических волн, что делает его трудно подсчитать количество акустической энергии, эффективно доставлен образец. Они также могут создавать нежелательные механические артефакты. Например размышления производится перпендикулярно акустическая несоответствие импеданс интерфейсы создания backpropagating волны, которые мешают те распространяющихся вперед. По пути вмешательства волны компенсируют друг друга на фиксированных регионах пространств под названием узлов и суммировать в чередующихся регионов под названием анти узлов, создание так называемого стоячие волны (рис. 1). Это важно для экспериментатор иметь возможность контролировать или устранить эти экспериментальные интерфейсов в пробирке , как они не могут существовать в естественных условиях.
Флуоресценции измерение оптических журналистов является известный метод допросить прозрачный биологических образцов в режиме реального времени и с без физического воздействия. Таким образом, этот подход идеально подходит для LIPUS исследований, как любой физической зондов, в районе sonicated представит механических артефактов. Этот протокол описывает внедрение и эксплуатация LIPUS для коммерческих epi флуоресцентным микроскопом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основным преимуществом фокусированного ультразвука является его способность неинвазивно доставить механических и/или тепловой энергии в биологических образцов с высокой точностью пространственно временной. Другие методы, предназначенные для механически стимулировать клетки обыч?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Drs. Михаил Шапиро и Никита Резник за плодотворные дискуссии. Эта работа была поддержана начальных средств от Западного университета медицинских наук и низ Грант R21NS101384.
Materials
| upright microscope with large working volume | Thorlabs | CERNA |
| upright microscope with large working volume | Scientifica | SliceScope |
| optomechanical components | Thorlabs | n/a |
| needle hydrophone | ONDA Corporation | HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier |
| needle hydrophone | Precision Acoustics | n/a |
| fiber optic hydrophone | ONDA Corporation | HFO series |
| fiber optic hydrophone | Precision Acoustics | n/a |
| oscilloscope | Keysight Technology | DSOX2004A (4-channels 70MHz) |
| function generator | Keysight Technology | 33500B (20MHz single-channel) |
| RF power amplifier | Electronic Navigation Industries (ENI) | 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA |
| RF power amplifier | Electronics & Innovation (E&I) | |
| immersion ultrasound transducer | Olympus | focused immersion transdcuers |
| immersion ultrasound transducer | Benthowave Instrument | HiFu transducer BII-76 series |
| immersion ultrasound transducer | Precision Acoustics | Piezo-ceramic or HiFu transducers |
| immersion ultrasound transducer | Ultrasonic-S-lab | HiFu transducers made to order |
| high-density Matrigel | Corning | VWR 80094-330 |
| Mylar film 2.5 microns | Chemplex | CAT.NO:107 |
Riferimenti
- Elhelf, I. A. S., et al. High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends. Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).
- Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. . Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , (2018).
- Duck, F. A. Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).
- Legon, W., et al. Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans. Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).
- Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).
- Tyler, W. J. Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis. Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).
- Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
- Tyler, W. J., et al. Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound. PloS One. 3 (10), e3511 (2008).
- Suarez Castellanos, I., et al. Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells. Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).
- Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).
- Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 6, 8264 (2015).
- Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).
- Kubanek, J., et al. Ultrasound modulates ion channel currents. Scientific Reports. 6, 24170 (2016).
- Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force. PloS One. 8 (10), e77115 (2013).
- Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism. Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).
- O’Brien, W. D. Ultrasound-biophysics mechanisms. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 8, 16148 (2017).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells. Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).
- Hwang, J. Y., et al. Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells. Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).
- Nakano, M., et al. Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response. PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).
- Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein. Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).
