Multiplexação focada a estimulação de ultra-som com microscopia de fluorescência

Summary

Estimulação de ultra-som pulsado da baixo-intensidade (U.S.P) é uma modalidade para a estimulação mecânica não-invasiva de células endógenas ou projetadas com alta resolução espacial e temporal. Este artigo descreve como implementar U.S.P para um microscópio de fluorescência-epi e como minimizar a incompatibilidade de impedância acústica ao longo do caminho de ultra-som para evitar artefatos mecânicos indesejáveis.

Abstract

Centrando-se pulsos de ultra-som de baixa intensidade que penetram os tecidos moles, U.S.P representa uma tecnologia promissora biomédica remotamente e com segurança manipular disparo neural, secreção hormonal e células reprogramadas geneticamente. No entanto, a tradução desta tecnologia para aplicações médicas atualmente é dificultada pela falta de mecanismos biofísicos pelo qual sentido de tecidos como alvo e responder a U.S.P. Uma abordagem adequada para identificar esses mecanismos seria usar biossensores ópticos em combinação com U.S.P para determinar subjacentes vias de sinalização. No entanto, implementar U.S.P a um microscópio de fluorescência pode introduzir artefatos mecânicos indesejáveis devido à presença de interfaces físicas que reflectem, absorvem e refratam ondas acústicas. Este artigo apresenta um procedimento passo a passo para incorporar U.S.P para microscópios comercialmente disponíveis na vertical epi-fluorescência, minimizando a influência das interfaces físicas ao longo do trajeto acústico. Um procedimento simples é descrito para operar um transdutor de ultrassom de elemento único e trazer a zona focal do transdutor para o ponto focal objectivo. O uso de U.S.P é ilustrado com um exemplo de transientes de cálcio U.S.P-induzida em células de glioblastoma humano culta medidas utilizando imagens de cálcio.

Introduction

Muitas doenças requerem alguma forma de intervenção médica invasiva. Estes procedimentos são muitas vezes caro, arriscado, requerem períodos de recuperação e, portanto, adicionar um fardo para sistemas de saúde. Modalidades terapêuticas não-invasivos têm potencial para fornecer alternativas mais seguras e mais baratas para procedimentos cirúrgicos convencionais. No entanto, as abordagens atuais não-invasiva como farmacoterapia ou transcraniana estimulação magnética frequentemente são limitadas pelo trade-offs entre a penetração do tecido, spatiotemporal resolução e efeitos indesejados fora do alvo. Neste contexto, um ultrasound focalizado constitui uma tecnologia promissora e não-invasiva com o potencial de manipular funções biológicas dentro de tecidos com alta precisão spatiotemporal e efeitos limitados fora do alvo.

Estimulação do ultrasound focalizado consiste de fornecimento de energia acústica em locais precisos dentro de organismos vivos. Dependendo dos parâmetros de pulso acústico, esta energia pode ter uma variedade de usos médicos. Por exemplo, a Food and Drug Administration aprovou o uso do ultra-som de focado de alta intensidade (HiFU) para ablação térmica de tumores de próstata, regiões do cérebro causando o tremor, miomas uterinos e causando dor de terminações nervosas em metástases ósseas¹ . Mediada por HiFu microbolhas cavitação também é usada para abrir transitoriamente a barreira sangue – cérebro, para a entrega de alvo da terapêutica administrada sistemicamente². A intensidade do pulso-média de pico espacial (eu_sppa) e pico espacial temporal-média intensidade (eu_spta) usado para HiFU aplicações são tipicamente acima vários kW cm^-2 e produzem a pressão de pulso de várias dezenas de MPa. Esses valores de intensidade são muito acima da FDA-aprovado_sppa e eu_spta limites para ultra-som diagnóstico, 190 W cm^-2 e 720 mW cm^-2, respectivamente³. Em contraste, estudos recentes demonstraram que a estimulação não-destrutivos ultra-som pulsado que estão dentro ou perto da gama de limites de intensidade do ultra-som diagnóstico (U.S.P.) pode ser eficaz para remotamente e com segurança manipular neural disparar^{4, 5,6,7,8}, secreção hormonal^9,10 e bioengenharia células¹¹. Ainda, os mecanismos celulares e moleculares pelos quais células detetam e respondem ao ultra-som permanecem pouco claras, impedindo a tradução clínica da U.S.P. Por isso, nos últimos anos, estudos de membranas artificiais, células cultivadas e animais estimulados com ultra-som ganharam ímpeto para revelar biofísicas e processos fisiológicos modulada por U.S.P^{12,13, 14,15}.

Som consiste de uma vibração de propagação através de um meio físico. Um ultra-som é um som com uma frequência acima da faixa audível humana (isto é, acima de 20 kHz). Em um ambiente de laboratório, ondas de ultra-som são geralmente produzidas por transdutores piezoelétricos que contêm um material que vibra em resposta a um campo elétrico oscilando em uma largura de banda alta frequência específica. Existem dois tipos de transdutores: único elemento transdutores e matrizes do transdutor. Transdutores piezoelétricos único elemento possuem uma superfície curva que atua como uma lente de focalização e, portanto, concentra a energia acústica em uma região definida, chamada de zona focal. Transdutores de elemento único são muito mais barato e mais fácil de operar do que matrizes de transdutor. Este artigo irá se concentrar em transdutores de elemento único.

O tamanho da zona focal de um transdutor de elemento único focalizado depende as Propriedades geométricas da lente acústica e sua frequência acústica. Para atingir uma zona focal milímetros-tamanho com um transdutor de elemento único, frequências de ultra-som na faixa de MHz são geralmente necessárias. Infelizmente, ondas acústicas numa frequência tão rapidamente são atenuadas quando propagadas em meio tênue como o ar. Assim, as ondas de ultra-som MHz precisam ser gerado e propagado para a amostra em um material mais denso como água. Este constitui o primeiro desafio em integrar a modalidade U.S.P a um microscópio.

Um segundo desafio é minimizar as interfaces físicas entre materiais com diferentes impedâncias acústicas (que é um produto da densidade do material e a velocidade acústica) ao longo do trajeto acústico. Estas interfaces podem refletir, refratar, dispersão e absorver ondas acústicas, tornando-se difícil de quantificar a quantidade de energia acústica efetivamente entregue a uma amostra. Também podem criar artefatos mecânicos indesejáveis. Por exemplo, interfaces de impedância de incompatibilidade perpendicular ao acústico produzido reflexões criam ondas backpropagating que interferem com os materiais de propagação para a frente. Ao longo do caminho de interferência, as ondas se cancelam mutuamente em regiões fixas de espaços chamados nós e resumir em alternando regiões chamadas antilinfonodos, criando so-called ondas estacionárias (Figura 1). É importante para o experimentalista ser capaz de controlar ou eliminar estas interfaces experimentais em vitro como eles não podem existir em vivo.

Medição de fluorescência de repórteres ópticas é um método conhecido para interrogar amostras biológicas transparentes em tempo real e com nenhum distúrbio físico. Esta abordagem é, portanto, ideal para estudos de U.S.P como qualquer sondas físicas presentes na área lisada irão introduzir artefatos mecânicos. Este protocolo descreve a implementação e operação de U.S.P a um microscópio de fluorescência-epi comercial.

Protocol

1. cultivo de células em película de poliéster acusticamente transparente Perfure um tamanho do furo de 12 mm no fundo de um prato de cultura padrão 35mm usando uma broca imprensa vertical. Mova a broca lentamente e use óculos de protecção. Retire os pedaços de plástico ligada ao fundo do prato usando uma lâmina para criar uma superfície lisa do lado externo (Figura 2). Aplique uma camada fina de fuzileiro naval-grau epóxi ou cola na superfície externa do fun…

Representative Results

A Figura 5 é um exemplo de experimento U.S.P multiplexado com imagem de cálcio. Células de glioblastoma (A-172) foram cultivadas em película de poliéster EMPM revestido em meio de cultura padrão (suplementado com 10% de soro e 1% de antibióticos) e incubadas com o repórter fluorescente sensíveis ao cálcio Fluo-4 AM. As células foram fotografadas usando uma lente de imersão 10 X e iluminado com uma fonte de luz branca LED e luz de fluorescência fo…

Discussion

A principal vantagem do ultrasound focalizado é sua capacidade de forma não-invasiva entregar a energia mecânica e/ou térmica para amostras biológicas com alta precisão espácio-temporais. Outras técnicas destinadas a estimular mecanicamente as células geralmente empregam invasiva sondas físico (por exemplo, célula-cutucando) ou requer a interação dos feixes de laser de alta energia com objectos estranhos (por exemplo, Pinça óptica). Aquecimento magnético pode aquecer locais geográficos …

Materials

upright microscope with large working volume	Thorlabs	CERNA
upright microscope with large working volume	Scientifica	SliceScope
optomechanical components	Thorlabs	n/a
needle hydrophone	ONDA Corporation	HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier
needle hydrophone	Precision Acoustics	n/a
fiber optic hydrophone	ONDA Corporation	HFO series
fiber optic hydrophone	Precision Acoustics	n/a
oscilloscope	Keysight Technology	DSOX2004A (4-channels 70MHz)
function generator	Keysight Technology	33500B (20MHz single-channel)
RF power amplifier	Electronic Navigation Industries (ENI)	325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA
RF power amplifier	Electronics & Innovation (E&I)
immersion ultrasound transducer	Olympus	focused immersion transdcuers
immersion ultrasound transducer	Benthowave Instrument	HiFu transducer BII-76 series
immersion ultrasound transducer	Precision Acoustics	Piezo-ceramic or HiFu transducers
immersion ultrasound transducer	Ultrasonic-S-lab	HiFu transducers made to order
high-density Matrigel	Corning	VWR 80094-330
Mylar film 2.5 microns	Chemplex	CAT.NO:107