형광 현미경과 초음파 자극에 초점을 맞춘 멀티플렉싱
Summary
낮은-강도 펄스 초음파 자극 (LIPUS)은 높은 공간 및 시간적 해상도 생 또는 조작 셀의 비-침략 적 기계적 자극에 대 한 양식 적임 이다. 이 문서는 피 형광 현미경 LIPUS를 구현 하는 방법 및 원치 않는 기계적 유물을 방지 하기 위해 초음파 경로 따라 음향 임피던스 불일치를 최소화 하는 방법에 설명 합니다.
Abstract
집중 함으로써 부드러운 조직에 침투 하는 저 강도 초음파 펄스, LIPUS 원격으로 그리고 안전 하 게 신경 발포, 호르몬 분 비 및 유전으로 재설정 셀을 조작 하는 유망한 생물 의학 기술을 나타냅니다. 그러나,에 의해 의료 응용 프로그램에 대 한이 기술의 번역 방해 현재는 생물 메커니즘의 부족 및 대상 조직 감각 LIPUS에 응답. 이러한 메커니즘을 식별 하는 적당 한 접근 LIPUS와 함께에서 광학 바이오 센서를 사용 하 여 기본 신호 경로 결정 하는 것입니다. 그러나, LIPUS를 구현 하는 형광 현미경에 물리적 인터페이스를 반영 하 고, 흡수 하 고 청각 파의 굴절의 존재로 인해 원치 않는 기계적 유물을 발생할 수 있습니다. 이 문서 음향 경로 따라 물리적 인터페이스의 영향을 최소화 하면서 상용 직 립 피 형광 현미경에 LIPUS를 통합 하는 단계별 절차를 제공 합니다. 단일 요소 초음파 트랜스듀서를 운영 하 고 객관적인 초점으로 변환기의 초점 영역을가지고 간단한 절차를 설명 합니다. LIPUS 사용 하 여 칼슘 이미징 사용 하 여 측정 하는 교양된 인간 세포종 세포에서 칼슘 LIPUS 유도 과도의 예를 보여 줍니다.
Introduction
많은 질병 침략 적 의료 개입의 일종이 필요합니다. 이 절차는 자주 비싼, 위험, 회복 기간을 필요로 하 고 따라서 의료 시스템에 부담을 추가 합니다. 비-침략 적 치료 modalities 기존의 수술을 안전 하 고 더 싼 대안을 제공 하 가능성이 있다. 그러나, 현재 비-침략 적 접근 pharmacotherapy 또는 transcranial 자석 자극 등 종종 조직 침투, spatiotemporal 해상도 및 원치 않는 오프 대상 효과 간에 의해 제한 됩니다. 이러한 맥락에서 집중 된 초음파 구성 하는 생물 학적 기능을 조작 하는 잠재력을 가진 유망한 비-침략 적 기술 제한 대상에서 효과 높은 spatiotemporal 정확도와 조직 깊숙한.
집중 된 초음파 자극 정확한 위치에서 음향 에너지를 제공 구성 생물 깊숙한. 음향 펄스 매개 변수에 따라이 에너지는 다양 한 의료 사용을 할 수 있습니다. 예를 들어, 식품 및 의약품 안전 청은의 사용을 승인 고 강도 집중 초음파 (장내) 전립선 종양, 뇌 영역 떨림 발생, 자 궁 fibroids 및 통증을 일으키는 뼈 전이1 신경 엔딩의 열 제거에 대 한 . 장내 중재 microbubble 현상 또한 체계적으로 관리 치료2의 대상된 배달에 대 한 혈액-뇌 장벽 정도 여는 데 사용 됩니다. 공간-피크 펄스 평균 강도 (내가sppa)와 공간-피크 시간 평균 강도 (내가spta) 장내 응용 프로그램은 일반적으로 몇 kW cm-2 위 및 펄스 압력 MPa의 몇몇 10의 생산에 사용. 이러한 강도 값은 멀리 위에 FDA 승인 난sppa 고spta 진단 초음파, 190 W c m-2 720 mW cm-2,3각각에 대 한 제한. 반면, 최근 연구 또는 진단 초음파 강도 한계 (LIPUS)의 범위에 가까운 수 수 효과적으로 그리고 안전 하 게 원격으로 조작 신경 발사4는 그 비 파괴적인 펄스 초음파 자극 5,6,7,8, 호르몬 분 비9,10 및 bioengineered 세포11. 그러나, 세포질이 고 분자 기계 장치는 셀 감지 및 초음파에 응답 유지 불분명, LIPUS의 임상 번역 제외. 따라서, 지난 몇 년 동안, 인공 막, 배양된 세포 및 동물 초음파 자극된의 연구 생물을 기세를 얻고 있다 및 생리 적 프로세스 LIPUS12,13, 변조 , 1415.
물리적 매체를 통해 전파 진동 소리에 의하여 이루어져 있다. 초음파는 이상 인간의 가청 범위 (즉, 20 k h z) 주파수를 가진 소리 이다. 실험실 환경에서 초음파 파도 일반적으로 특정 높은 주파수 대역폭에서 진동 전기 필드에 대 한 응답에서 진동 하는 물자를 포함 하는 압 전 트랜스듀서에 의해 생산 됩니다. 변환기의 두 가지 유형의 존재: 요소 변환기 및 변환기 배열. 단일 요소 압 전 트랜스듀서는 초점 렌즈 역할을 하며 따라서 음향 에너지를 집중 하 고 초점 영역 이라고 정의 된 지역으로 곡선된 표면 소유. 단일 요소 변환기는 훨씬 저렴 하 고 변환기 배열 보다 운영 하기가 있습니다. 이 문서는 단일 요소 변환기에 집중할 것 이다.
집중 된 단일 요소 변환기의 초점 영역의 크기에는 음향 주파수와 음향 렌즈의 기하학적 속성에 따라 달라 집니다. 단일 요소 변환기와 밀리미터 크기 초점 영역을 달성 하기 위해 초음파 주파수 MHz 범위에는 일반적으로 필요 합니다. 불행 하 게도, 같은 주파수에서 청각 파 공기 같은 얇은 매체에 전파 될 때 감쇠 매우 빠르게 있습니다. 따라서, MHz 초음파 파도 생성 하 고 물과 같은 농도 자료 샘플을 전파 해야 합니다. 이 구성 LIPUS 적임 현미경에 통합에 첫 도전 합니다.
두 번째 도전은 다른 음향 임피던스 (재료 밀도 및 음향 속도의 제품에는) 음향 경로 재료 사이의 물리적 인터페이스를 최소화 하는 것 이다. 이러한 인터페이스 수 반영, 굴절, 분산 하 고 샘플을 효과적으로 전달 하는 음향 에너지의 양을 계량 하 고 어려운 청각 파 흡수. 그들은 또한 원치 않는 기계 공예품을 만들 수 있습니다. 예를 들어, 반사 생산된 음향에 수직 불일치 임피던스 인터페이스는 backpropagating 파도 앞으로 전파 하는 것을 방해 하는 만듭니다. 간섭 경로 따라 파도 취소 서로 노드 및 안티 노드, 지역 교류에서 합계 라는 공간의 고정된 지역에서 소위 서 파도 (그림 1)를 만들어. 그것을 제어 하거나 이러한 실험적인 인터페이스 시험관 에 비보없을 수 있습니다 제거 수 experimentalist에 대 한 중요 하다.
형광 측정 광 기자 들의 투명 한 생물 학적 샘플 없이 실제 소요와 실시간으로 잘 알려진 방법입니다. 이 접근은 따라서 어떤 물리적 프로브 sonicated 지역에 기계적 유물 소개로 LIPUS 연구에 이상적입니다. 이 프로토콜 구현 및 상업 epi-형광 현미경 LIPUS의 운영에 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
집중 된 초음파의 주요 장점은 비 접촉 spatio 시간적 고정밀 생물학 견본에 기계적 또는 열 에너지를 전달 하는 기능입니다. 기계적으로 자극 하기 위한 다른 기술을 일반적으로 고용 침략 물리적 프로브 (예를 들어, 셀 파고) 세포 또는 외국 개체 (예: 광학 족집게)와 높은 에너지 레이저 광선의 상호 작용을 요구 한다. 마그네틱 난방 생물 학적 샘플 내부 특정 공간 위치를 열 수 있습?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 박사 미하일 샤 피로 니키타 Reznik 유익한 토론에 대 한 감사. 이 작품은 웨스턴 대학 보건 과학에서 시작 자금에 의해 지원 되었다 고 NIH R21NS101384를 부여 합니다.
Materials
| upright microscope with large working volume | Thorlabs | CERNA |
| upright microscope with large working volume | Scientifica | SliceScope |
| optomechanical components | Thorlabs | n/a |
| needle hydrophone | ONDA Corporation | HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier |
| needle hydrophone | Precision Acoustics | n/a |
| fiber optic hydrophone | ONDA Corporation | HFO series |
| fiber optic hydrophone | Precision Acoustics | n/a |
| oscilloscope | Keysight Technology | DSOX2004A (4-channels 70MHz) |
| function generator | Keysight Technology | 33500B (20MHz single-channel) |
| RF power amplifier | Electronic Navigation Industries (ENI) | 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA |
| RF power amplifier | Electronics & Innovation (E&I) | |
| immersion ultrasound transducer | Olympus | focused immersion transdcuers |
| immersion ultrasound transducer | Benthowave Instrument | HiFu transducer BII-76 series |
| immersion ultrasound transducer | Precision Acoustics | Piezo-ceramic or HiFu transducers |
| immersion ultrasound transducer | Ultrasonic-S-lab | HiFu transducers made to order |
| high-density Matrigel | Corning | VWR 80094-330 |
| Mylar film 2.5 microns | Chemplex | CAT.NO:107 |
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