La distribution d'eau de Xylem dans les usines ligneuses visualisée avec un microscope électronique cryo-scanné
Summary
L’observation de la distribution d’eau dans le xylisme fournit des informations significatives sur la dynamique du débit d’eau dans les plantes ligneuses. Dans cette étude, nous démontrons l’approche pratique pour observer la distribution d’eau de xylée in situ en utilisant un cryostat et cryo-SEM, qui élimine les changements artifactual dans l’état de l’eau pendant la préparation de l’échantillon.
Abstract
Un microscope électronique à balayage installé cryo-unité (cryo-SEM) permet l’observation des spécimens à des températures inférieures à zéro et a été utilisé pour explorer la distribution d’eau dans les tissus végétaux en combinaison avec des techniques de fixation du gel à l’aide d’azote liquide (LN 2). Pour les espèces ligneuses, cependant, les préparations pour l’observation de la surface transversale du xylisme impliquent certaines difficultés en raison de l’orientation des fibres de bois. En outre, une tension plus élevée dans la colonne d’eau dans les conduits de xylée peut parfois provoquer des changements artificiels dans la distribution de l’eau, en particulier lors de la fixation et la collecte de l’échantillon. Dans cette étude, nous démontrons une procédure efficace pour observer la distribution d’eau dans le xylisme des plantes ligneuses in situ en utilisant un cryostat et cryo-SEM. Dans un premier temps, lors de la collecte de l’échantillon, la mesure du potentiel d’eau xylée devrait déterminer si une tension élevée est présente dans les conduits de xylisme. Lorsque le potentiel d’eau du xylée est faible (lt; vers 0,5 MPa), une procédure de relaxation de tension est nécessaire pour faciliter une meilleure préservation de l’état de l’eau dans les conduits de xylée pendant la fixation du gel de l’échantillon. Ensuite, un collier étanche est fixé autour de la tige de l’arbre et rempli de LN2 pour la fixation de gel de l’état de l’eau du xylème. Après la récolte, il faut veiller à ce que l’échantillon soit conservé congelé tout en complétant les procédures de préparation à l’observation de l’échantillon. Un cryostat est utilisé pour exposer clairement la surface transversale du xylisme. Dans les observations cryo-SEM, l’ajustement du temps pour le gel-gravure est nécessaire pour enlever la poussière de gel et d’accentuer le bord des parois cellulaires sur la surface d’observation. Nos résultats démontrent l’applicabilité des techniques cryo-SEM pour l’observation de la distribution d’eau dans le xylisme aux niveaux cellulaire et subcellulaire. La combinaison de cryo-SEM avec des techniques d’observation in situ non destructive améliorera profondément l’exploration de la dynamique du débit d’eau des plantes ligneuses.
Introduction
La disponibilité des ressources en eau (c.-à-d. précipitations, teneur en eau du sol) détermine strictement la mortalité et la répartition géographique des espèces végétales, puisqu’elles doivent absorber l’eau du sol et la transporter vers les feuilles pour la production photosynthétique. Les usines doivent maintenir leur système de transport d’eau sous des approvisionnements fluctuants en eau. En particulier, les plantes ligneuses génèrent de fortes tensions dans leurs conduits le long des cours d’eau de transpiration car, dans certains cas, elles doivent tenir leur couronne à plus de 100 m au-dessus du sol. Pour maintenir des colonnes d’eau sous une pression négative aussi élevée, les conduits de xylée se composent d’un continuum de cellules tubulaires avec des parois cellulaires rigides et hydrophobes lignifiées1. La vulnérabilité au dysfonctionnement du xylée des conduits de xylisdans chaque espèce est un bon déterminant de la survie de l’espèce sous l’approvisionnement fluctuant en eau2. En outre, l’étude de l’état de l’eau des conduits de xylée est importante pour l’évaluation de l’état de santé des arbres individuels soumis à des stress abiotiques ou biotiques. La mesure du débit de sève ou du potentiel d’eau peut fournir des estimations de l’état de l’eau d’une usine ligneuse en raison de la fonction hydraulique intégrée des conduits de xylisme. En outre, la visualisation de la distribution de l’eau dans les cellules xylées peut clarifier l’état des composants individuels du système hydraulique xylée.
Plusieurs techniques de visualisation de l’état de l’eau des conduits de xylage existent3. Les méthodes classiques et utiles pour observer les voies d’eau dans les tissus ligneux impliquent de tacher la colonne d’eau en plongeant les extrémités des branches coupées dans un colorant ou en injectant un colorant dans les tiges d’arbres debout4. La photographie aux rayons X souple permet également la visualisation de la distribution de l’eau des disques de bois tranchés en raison de l’intensité différentielle d’absorption des rayons X de l’humidité dans le xylisme5,6. Ces méthodes, cependant, ne fournissent que des traces de mouvement de l’eau ou démontrent des distributions macroscopiques de l’eau. Récemment, les techniques d’observation non destructives, telles que la tomographie calculée par rayons X micro focus (CT)7,8,9,10et l’imagerie par résonance magnétique (IRM)11, 12, ont été considérablement améliorés pour permettre l’observation de l’eau dans les conduits de xylage dans les jeunes arbres intacts. Ces méthodes non destructives ont de grands avantages en ce que nous pouvons observer l’état de l’eau du xylèm sans effets de coupe artificielles, et nous pouvons suivre la dynamique du débit d’eau par imagerie séquentielle ou l’introduction d’un agent de contraste10. Cependant, nous devons utiliser une IRM personnalisée pour l’imagerie végétale ou une installation spécialisée pour l’OstT à base de synchrotron afin d’obtenir les images qui peuvent identifier la teneur en eau au niveau cellulaire. En outre, bien que le système de TCT à base de synchrotron ait permis d’obtenir des images fines avec une haute résolution spatiale, ce qui est comparable à la microscopie légère7,8,9, les cellules vivantes peuvent être blessées par le rayonnement de rayons X à haute énergie13,14. L’utilisation d’un microscope électronique à balayage dans lequel des cryo-unités sont installées (cryo-SEM) est une méthode très utile pour localiser précisément l’eau dans le xylisme au niveau cellulaire, bien que cela nécessite la récolte destructrice de l’échantillon pour l’observation. Pour fixer l’eau dans les conduits de xylème, une partie des tiges (c.-à-d. brindilles, branches ou tiges) sont congelées in situ par l’azote liquide (LN2). Les observations de la surface des spécimens congelés et taillés par cryo-SEM fournissent des images très amples de la structure du xylisme à partir de laquelle nous pouvons identifier l’eau dans les conduits de xylée comme de la glace. Une limitation importante de cette méthode est qu’il est impossible d’observer séquentiel la movabilité de l’eau dans le même échantillon. Cependant, l’application de l’ItC ou de l’IRM pour l’observation séquentielle des arbres qui vivent dans un champ est extrêmement difficile parce que ces instruments ne sont pas portables. En revanche, cryo-SEM a un potentiel pour utiliser cette technique sur les grands arbres dans les expériences sur le terrain pour visualiser clairement le contenu de l’eau non seulement au niveau cellulaire, mais aussi à un niveau de structure plus fine, par exemple, l’eau dans les fosses intervasculaires15, l’eau dans espaces intercellulaires16, ou bulles dans la colonne d’eau17.
Beaucoup d’études observant l’eau de xylem par cryo-SEM ont été rapportées 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et coll. (1996) ont d’abord établi le protocole d’observation du xylème in situ par congélation d’un tronc vivant en remplissant le LN2 dans un récipient fixé sur la tige21. La température de l’échantillon a été maintenue en dessous de -20 oC pendant la collecte de l’échantillon et pendant la préparation cryo-SEM afin d’éviter de faire fondre la glace dans des conduits de xylisme. Cette méthode a été utilisée pour observer l’eau dans le xylisme afin de clarifier la distribution de l’eau sous le régime changeant de l’eau11,12,24,25,26, 27,28, la variation saisonnière de la distribution d’eau21,29,30, l’effet des cycles de gel-dégel17,31, 32, la distribution de l’eau dans le bois humide5, les changements dans la distribution de l’eau au cours de la transition du bois de sève au bois de coeur20, le cours saisonnier de temps de l’activité cambiale et la différenciation des navires33, et la cavitation induite par certains stress biotiques23,34. La conductivité hydraulique et la vulnérabilité des conduits à la cavitation ont également été vérifiées à l’aide de cryo-SEM35,36. Cryo-SEM équipé d’une spectrométrie de rayons X dispersive séduismnisée (EDX ou EDS) a été utilisé pour étudier la distribution des éléments à la surface d’un spécimen contenant de l’eau37.
La fixation par congélation d’un tronc vivant qui contient des conduits sous haute tension hydraulique provoque parfois des cavitations artificielles qui sont observées par cryo-SEM comme cristaux de glace fracturés dans le lumen des conduits38,39. En particulier, les espèces à larges deleurs avec des conduits plus longs et plus larges sont vulnérables aux artefacts induits par la tension, tels que la cavitation causée par la coupe d’échantillons, même si elle est menée sous l’eau3,40. Les artefacts de cavitation deviennent visibles après l’échantillonnage d’un arbre qui transpire (c.-à-d. l’échantillonnage pendant la journée) ou dans de graves conditions de sécheresse et ils peuvent induire en erreur une surestimation de l’occurrence de cavitation3,38, 39. Par conséquent, la tension de travail dans les conduits doit être libéré afin d’éviter la cavitation artifactual3,12,39.
La technique de congélation-fracture à l’aide d’un couteau installé dans une chambre de spécimen est souvent employée pour exposer la surface de spécimen pour l’observation cryo-SEM. Cependant, les plans gelés des tissus végétaux ligneux, en particulier les sections transversales du xylisme secondaire, sont trop rugueux pour observer clairement les caractéristiques anatomiques et l’eau dans le tissu6. L’application d’un cryostat pour l’élagage d’un spécimen permet une préparation rapide et de haute qualité des surfaces d’échantillon20,23. L’objectif global de cette méthode est de fournir des preuves avec la résolution de microscopie électronique de la distribution de l’eau dans divers types de cellules xylées in situ sans l’occurrence d’artefacts d’échantillonnage. Nous introduisons notre procédure mise à jour, qui a été régulièrement améliorée depuis que nous l’avons adoptée pour la première fois, en ce qui concerne l’échantillonnage, la coupe et le nettoyage de la surface du spécimen pour obtenir des micrographes électroniques de haute qualité d’échantillons cryo-fixes de xylisme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes d’observation cryo-SEM introduites dans ce document sont pratiques pour visualiser clairement la distribution de l’eau à l’échelle cellulaire. Grâce à cette méthode, l’exploration des changements dans la distribution de l’eau dans le xylisme peut potentiellement aider à clarifier le mécanisme de tolérance des espèces d’arbres au stress abiotique (pénurie d’eau ou de congélation) ou au stress biotique (maladie des arbres).
L’étape la plus cruciale de cette méthode est…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI (No. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)
Materials
| coating material | JOEL Ltd., Japan | Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499 | |
| cryo scanning electron microscope | JOEL Ltd., Japan | JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS | |
| cryostat | Thermo Scientific | CryoStar NX70 | |
| microtome blade | Thermo Scientific | HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735 | |
| tissue freezing embedding medium | Thermo Scientific | Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006 |
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