התפלגות המים xylem במפעלי וודי דמיינו בעזרת מיקרוסקופ אלקטרוני לסריקת ההקפאה

Summary

התבוננות בחלוקת המים בתוך העצה מספקת מידע משמעותי בנוגע לדינמיקה של זרימת מים בצמחי הודי. במחקר זה, אנו מדגימים את הגישה המעשית להתבונן הפצת מים עצה באתרו באמצעות קריוסטט ו-הקפאה-SEM, אשר מבטלת שינויים מעשיים במצב המים במהלך הכנת המדגם.

Abstract

מיקרוסקופ אלקטרוני סריקה מותקן מותקנת-יחידת (ההקפאה-SEM) מאפשר תצפית דגימה בטמפרטורות מתחת ושימש לחקר הפצת מים ברקמות הצמח בשילוב עם הקפאת טכניקות קיבוע באמצעות חנקן נוזלי ( _{ב 2}). עבור מינים וודי, עם זאת, ההכנות להתבוננות במשטח החתך הרוחבי של עצה כרוכות בקשיים כתוצאה מכיוון של סיבי עץ. בנוסף, מתח גבוה יותר בעמודת המים ב-עצה יכול מדי פעם לגרום לשינויים העובדתיים בהפצת המים, במיוחד במהלך קיבוע המדגם והגבייה. במחקר זה, אנו להפגין הליך יעיל להתבונן התפלגות המים בתוך עצה של צמחים וודי באתרו באמצעות קריוסטט ו-הקפאה-SEM. בתחילה, במהלך איסוף המדגם, מדידת פוטנציאל המים עצה צריך לקבוע אם המתח הגבוה נמצא בתעלות עצה. כאשר הפוטנציאל הגלום במים נמוך (< ca. 0.5 MPa), נדרש הליך הרפיה במתח כדי לאפשר שימור טוב יותר של מעמד המים ב-עצה במהלך דגימת קיבוע ההקפאה. בשלב הבא, צווארון המים האטומה מוצמד מסביב לגבעול העץ ומתמלא ב-LN₂ לצורך הקפאת הקיבעון של מעמד המיים של xylem. לאחר הקציר, יש לנקוט כדי להבטיח כי המדגם נשמר קפוא תוך השלמת ההליכים של הכנה לדוגמה להתבוננות. קריוסטט מועסק בבירור לחשוף את המשטח הרוחבי עצה. בתצפיות ההקפאה, התאמת הזמן לחריטה בהקפאה נדרשת כדי להסיר אבק כפור ולהדגיש את קצה קירות התא על משטח הצפייה. התוצאות שלנו להפגין את תחולת טכניקות ההקפאה-SEM להתבוננות של הפצת מים בתוך עצה ברמות סלולר ו subcellular. השילוב של ההקפאה-SEM עם שאינם הרסניים טכניקות תצפית באתרו יהיה מאוד לשפר את החקירה של הדינמיקה זרימת מים צמח וודי.

Introduction

זמינות של משאבי מים (כלומר, משקעים, תוכן אדמה) קובעת בקפדנות את התמותה ואת ההתפלגות הגיאוגרפית של מינים צמחיים, שכן הם צריכים לקלוט מים מהאדמה ולהעביר אותו לעלים לייצור פוטוסינתטי. הצמחים חייבים לשמור על מערכת התחבורה. המים שלהם תחת תנודות המים בפרט, צמחים וודי ליצור מתחים גבוהים התעלות שלהם לאורך הזרמים דיות כמו, במקרים מסוימים, הם צריכים להחזיק את הכתר שלהם יותר מ ~ 100 m מעל הקרקע. כדי לשמור על עמודי המים בלחץ שלילי כה גבוה, מורכבות התעלות ברצף של תאים צינורי עם קירות תאים קשיחים והידרופוביות מסוג¹. הפגיעות בתפקוד הלקוי של המין השני במינים היא הדטרמיננטה טובה של הישרדות המינים תחת אספקתהמים. בנוסף, לימוד מעמד המים של התעלות הוא חשוב להערכת מצבם הבריאותי של העצים הבודדים החשופים ללחצים בריאותיים או ביוטיים. מדידת זרימת sap או פוטנציאל מים יכול לספק הערכות של מעמד המים של צמח וודי בשל הפונקציה הידראולי משולבת של התעלות עצה. יתר על כן, להמחיש את התפלגות המים בתאי עצה יכול להבהיר את המצב של רכיבים בודדים של מערכת הידראולי עצה.

מספר טכניקות להמחיש את מצב המים של התעלות האלה הם³. השיטות הקלאסיות והשימושיות להתבוננות במסלולי המים ברקמת העור כרוכות בצביעת עמודת המים על-ידי הטבאתה בקצות הענפים החתוכים לצבע או על-ידי הזרקת צבע לתוך עץ עומד. צילומי רנטגן רכים מאפשרים גם הדמיה של הפצת מים של דיסקי עץ חתוכים בשל עוצמת הספיגה הדיפרנציאלי של קרני רנטגן של הלחות ב-עצה^5,6. שיטות אלו, עם זאת, מספקות רק שירים של תנועת מים או הפגנת הפצות מאקרוסקופי במים. לאחרונה, טכניקות תצפית שאינן הרסניות, כגון מיקרו מיקוד רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (μct)^7,8,9,10ודימות תהודה מגנטית (MRI)^{11, 12}, שופרו באופן משמעותי כדי לאפשר השגחה של מים בתוך שתילים שלמים. לשיטות אלה שאינן הרסניות יש יתרונות גדולים בכך שאנו יכולים להתבונן במצב המים של xylem ללא אפקטים מלאכותיים, ואנו יכולים לעקוב אחר הדינמיקה של זרימת המים באמצעות הדמיה רציפה או החדרת סוכן ניגודיות¹⁰. עם זאת, אנחנו צריכים להשתמש ב-MRI מותאם אישית עבור הדמיה של הצמח או מתקן מיוחד עבור Μסינכרוטרון מבוסס-Ct כדי לקבל את התמונות אשר יכול לזהות תוכן המים ברמה התאית. בנוסף, למרות מערכת μct מבוסס סינכרוטרון לקבל תמונות משובחות עם רזולוציה מרחבית גבוהה, הדומה למיקרוסקופיה קלה^7,8,9, תאים חיים יכולים להיפגע על ידי ה קרינה של אנרגיה גבוהה X-ray^13,14. שימוש במיקרוסקופ אלקטרוני סריקה שבו יחידות ההקפאה מותקנות (ההקפאה-SEM) היא שיטה שימושית מאוד לאיתור בדיוק את המים ב-עצה ברמה התאית, למרות שהדבר דורש לקצור את הדגימה להסתכלות. כדי לתקן את המים ב-עצה, חלק מהגבעולים (כלומר, זרדים, ענפים או גבעולים) קפואים באתרו על ידי חנקן נוזלי (LN₂). תצפיות של פני השטח של גזוז, יצורים קפואים על ידי ההקפאה-SEM לספק תמונות מוגדלות ביותר של מבנה עצה שממנו אנו יכולים לזהות את המים ב-עצה כקרח. הגבלה משמעותית של שיטה זו היא כי התבוננות רציפה על מתנוכי המים בתוך אותה דוגמית היא בלתי אפשרית. עם זאת, היישום של μCT או MRI עבור התבוננות רציפה של עצים החיים בשדה הוא מאוד מאתגר משום שמכשירים אלה אינם ניידים. לעומת זאת, לבית-SEM יש פוטנציאל לשימוש בטכניקה זו על עצים גדולים בניסויים בשטח כדי להמחיש בבהירות את תוכן המים במישור הסלולר בלבד, אלא גם ברמת מבנה עדינה יותר, למשל, מים בבורות בין-כלים¹⁵, מים ב החללים הבינתאיים¹⁶, או בועות בעמודת המים¹⁷.

מחקרים רבים התבוננות מים עצה על ידי ההקפאה-SEM דווחו ^{5,12,18,19,20,21,23}. Utsumi ואח ‘ (1996) הקים בתחילה את הפרוטוקול להתבוננות של עצה באתרו על ידי הקפאת קיבעון של גזע חי באמצעות מילוי LN₂ לתוך מיכל להגדיר על גזע²¹. הטמפרטורה של המדגם נשמרה למטה-20 ° c במהלך איסוף המדגם במהלך הכנת ההקפאה-SEM כדי למנוע המסת הקרח בתוך התעלות עצה. שיטה זו שימש להתבונן במים ב-עצה כדי להבהיר את הפצת המים תחת שינוי משטר המים^11,12,24,^25,26, ^27,28, הווריאציה העונתית של הפצת מים^21,29,30, ההשפעה של מחזורים להפשיר הקפאה^{17,31, 32}, התפלגות המים בעץ רטוב⁵, שינויים בחלוקת המים במהלך המעבר מ סאפרווד לשמוע²⁰, קורס הזמן העונתי של פעילות הקמשוקה והבידול של כלי³³, והתוצאה הנגרמת על ידי מתחים ביוטיים מסוימים^23,34. מוליכות הידראולית ופגיעות תעלות כדי קוויטציה גם אומתו באמצעות ההקפאה-SEM^35,36. המלון שימש לחקר התפלגות אלמנט על פני השטח של מדגם המכיל מים³⁷, והוא מצויד באנרגיה המדלדת בעזרת הספקטרומטריה.

הקפאת קיבוע של גזע חי אשר מכיל תעלות תחת מתח הידראולי גבוה לעיתים גורם cavitations אשר נצפו על ידי המקפיא-SEM כמו גבישי קרח שבורות לומן של תעלות^38,39. במיוחד, מינים ברועלים עם תעלות ארוכות ורחבות יותר פגיעים לחפצים הנובעים ממתח, כגון הפחתת החיתוך של המדגם, גם אם בוצעו מתחת למים^3,40. הממצאים החזותיים להיות בולט לאחר הדגימה של עץ הטרנס (כלומר, הדגימה בזמן היום) או בתנאים חמורים בצורת והם יכולים להטעות הערכה יתר של מופע מוגזם^{3,38, 39}. לפיכך, יש לשחרר את המתח העובד בתעלות כדי למנוע את האפשרות הארטיטיבית^3,12,³⁹.

טכניקת שבר ההקפאה באמצעות סכין מותקן בחדר דגימה מועסק לעתים קרובות כדי לחשוף את משטח הדגימה עבור התבוננות ההקפאה-SEM. עם זאת, הקפאת שבורה מטוסים של רקמות הצמח וודי, במיוחד בחלקים רוחבי של xylem משני, הם גסים מדי כדי להתבונן בבהירות תכונות אנטומית ומים ברקמה⁶. היישום של קריוסטט עבור זמירה דגימה מאפשר הכנה מהירה ובאיכות גבוהה של משטחים לדוגמה^20,23. המטרה הכוללת של שיטה זו היא מתן ראיות עם הרזולוציה אלקטרון מיקרוסקופ של התפלגות המים בסוגים שונים של תאים עצה באתרו ללא התרחשות של חפצי הדגימה. אנו מציגים את ההליך המעודכן שלנו, אשר כבר השתפר בהתמדה מאז שאימצנו אותו לראשונה, לגבי הדגימה, זמירה וניקוי משטח הדגימה להשגת מיקרוגרפים אלקטרונים באיכות גבוהה של דגימות מתקן ההקפאה של xylem.

Protocol

הערה: תרשים סכמטי של פרוטוקול זה מוצג באיור 1. 1. דגימה: הרפיה מתיחות בתוך עמודת המים של קסיאו-תעלות הערה: טיפול ההרפיה הבאה מומלץ לפני היישום LN2 כדי להימנע מהקפאה וממתחים-חפצים המושרה בהפצת המים הקפילאם. הקף ענף ועלים לדיגום עם שקית נ…

Representative Results

תמונות מייצגות של משטחי חיתוך רוחבי של עץ מחטניים וברועלים, שנצפתה על ידי המקפיא-SEM, מוצגים באיור 2. בהגדלה הנמוכה, האזור השחור בתמונות מציין את החללים שמהם המים לחלוטין או בחלקו נעלמים, והאזור האפור מצביע על קירות תא מסוימים, ציטופלסמה ומים (איו…

Discussion

שיטות ההתבוננות ב-“קריו-SEM” שהוצגו במסמך זה מעשיות לצורך המחשה מהירה של חלוקת המים בקנה מידה תאי. באמצעות שיטה זו, לחקור את השינויים בחלוקת המים בתוך עצה יכול לעזור להבהיר את המנגנון של מינים העצים סובלנות ללחץ אביוטיים (מחסור במים או הקפאה) או מתחים ביוטי (מחלת עץ).

הצעד המכרי?…

Materials

coating material	JOEL Ltd., Japan	Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499
cryo scanning electron microscope	JOEL Ltd., Japan	JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX70
microtome blade	Thermo Scientific	HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium	Thermo Scientific	Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006