Beeinträchtigung der Endothelzellen und glialen Barrieren des Referats neurovaskuläre während experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis In Vivo Visualisierung

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um die Beeinträchtigung der neurovaskuläre Einheit während experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in vivo zu untersuchen. Wir gezielt auf Durchlässigkeit der Blut – Hirn-Schranke und Gelatinase Tätigkeit in Leukozyte Migration über die Glia Limitans ermitteln.

Abstract

Die neurovaskuläre Einheit (NVU) besteht aus mikrovaskuläre Endothelzellen bilden die Blut – Hirn-Schranke (BBB), einer endothelialen Basalmembran mit eingebetteten Perizyten und die Glia Limitans komponiert von parenchymatösen Basalmembran und astrocytic Ende-Feed den abluminalen Aspekt des zentralen Nervensystems (ZNS) Mikrogefäßen umarmen. Neben der Aufrechterhaltung CNS steuert Homöostase der NVU Immunzelle Menschenhandel in das ZNS. Während der Tumorüberwachung des ZNS können niedrige Anzahl von aktivierten Lymphozyten die endotheliale Barriere überqueren, ohne BBB Dysfunktion oder klinische Krankheit zu verursachen. Im Gegensatz dazu kann bei Neuroinflammation wie z. B. Multiple Sklerose oder seine Tiermodell experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) eine große Anzahl von Immunzellen die BBB und anschließend die Glia Limitans erreicht schließlich die CNS Parenchym durchqueren zum klinischen Erkrankung. Immunzelle Migration in das CNS-Parenchym ist somit ein zweistufiger Prozess, der eine sequentielle Migration über die Endothelzellen und glialen Barriere der NVU beschäftigt verschiedene molekulare Mechanismen beinhaltet. Wenn ihre Passage über die endotheliale Barriere, T-Zellen begegnen ihr cognate Antigen auf perivaskuläre Antigen-präsentierenden Zellen ihre lokale Reaktivierung löst weitere Mechanismen, die die fokale Aktivierung des Gelatinases, die die T-Zellen, die Glia-Schranke, und geben die CNS Parenchym ermöglicht. So erlaubt die Bewertung BBB Permeabilität sowohl MMP-Aktivität in räumliche Korrelation zu Immunzelle Akkumulation im ZNS bei EAE Verlust der Integrität der Endothelzellen und glialen Barrieren der NVU angeben. Wir zeigen hier wie induzieren EAE bei C57BL/6 Mäusen durch aktive Immunisierung und anschließend BBB Permeabilität in-vivo mit einer Kombination von exogenen Fluoreszenz Tracer analysieren. Weiter zeigen wir, wie zu visualisieren und Gelatinase Aktivität in EAE Gehirnen von in-situ Zymogaphy gekoppelt an immunofluorescent Färbungen von BBB Keller Membranen und CD45 + eindringenden Immunzellen zu lokalisieren.

Introduction

Das zentrale Nervensystem (ZNS) koordiniert alle Körper und geistige Funktionen bei Wirbeltieren und CNS Homöostase ist essentiell für eine ordnungsgemäße Kommunikation von Nervenzellen. CNS-Homöostase ist gerechtfertigt durch die neurovaskuläre Einheit (NVU), schützt das ZNS aus dem veränderten Milieu den Blutstrom. Die NVU besteht aus CNS mikrovaskuläre Endothelzellen, die biochemisch einzigartig und die Blut – Hirn-Schranke (BBB) in kontinuierlichen Übersprechen mit Perizyten, Astrozyten und Neuronen Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) zu etablieren, über zwei ausgeprägte Keller Membranen¹. Der endothelialen Basalmembran, Ensheathes der abluminalen Aspekt der BBB Endothelzellen birgt eine hohe Anzahl von Perizyten und besteht aus Laminin α4 und Laminin α5, neben anderen ECM-Proteine-². Im Gegensatz dazu der parenchymatösen Basalmembran besteht aus Laminin α1 und α2 Laminin und ist umgeben von astrocytic Ende-Füße. Die parenchymatösen Basalmembran zusammen mit den Astrozyten Ende-Füßen komponiert die Glia Limitans, die das CNS neuronale Netz aus dem Liquor cerebrospinalis gefüllt perivaskuläre oder Subarachnoidalraum Räume³segregiert. Durch die einzigartige Architektur der NVU unterscheidet sich Immunzellen in das ZNS Menschenhandel aus, dass in peripheren Geweben da es einen zweistufiger Prozess mit den Immunzellen erfordert, zuerst die endotheliale BBB und anschließend die Glia Limitans zur Verletzung Das CNS-Parenchym zu erreichen.

Multiple Sklerose (MS) ist eine häufige schwere Erkrankung des ZNS, in denen eine große Anzahl der zirkulierenden Immunzellen geben Sie die CNS und Neuroinflammation, Demyelinisierung und fokal Verlust von BBB Integrität⁴verursachen. Verlust der Integrität der BBB ist eine frühe Markenzeichen von MS, wie durch die Anwesenheit von Gadolinium Kontrast Verbesserung der Läsionen im ZNS als visualisierte durch Magnetresonanz-Bildgebung (MRI)⁵angezeigt. Leukozyte Extravasation in das ZNS tritt auf der Ebene der postcapillary Venolen; Allerdings bleiben die genauen Mechanismen beteiligt Immunzelle Diapedese der BBB Basalmembran und anschließend die glialen Barriere um erkundet zu werden. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) dient als Tiermodell für MS und hat maßgeblich zu unserem aktuellen Wissen über die Pathogenese der MS. Zum Beispiel wurde mit dem EAE-Modell entdeckt, dass Leukozyte Extravasation in einem mehrstufigen Prozess erfolgt, wie z. B. eine anfängliche Capture und Rollen Schritt durch Selectins und Mucin-ähnliche Moleküle wie z. B. P-Selektin Glykoprotein Liganden (PSGL) -1 vermittelt, gefolgt von Integrin-abhängige feste Verhaftung und kriechen von T-Zellen auf BBB Endothelzellen zu freizügigen Seiten für Diapedese⁶.

Wenn T-Zellen die endotheliale BBB und der endothelialen Basalmembran überquert haben, müssen sie ihre cognate Antigen auf Makrophagen oder dendritischen Zellen strategisch lokalisiert in den Leptomeningeal oder perivaskuläre Räumen begegnen. Diese Interaktion induziert Schwerpunkt Produktion von Pro-inflammatorischen Mediatoren diesen Auslöser die folgenden Mechanismen für CNS-Gewebe-Invasion von Immunzellen über die Glia Limitans^7,8,9erforderlich. Fokale Aktivierung von Matrix-Metalloproteinasen (MMP) -2 und MMP-9 ändert Chemokin Aktivierung und induziert Abbau der extrazellulären Matrix Rezeptoren auf Astrozyten Ende-Füße, eine Voraussetzung für Immune Zelle Migration über die Glia Limitans in der CNS Parenchym und Beginn der klinischen Symptome von EAE^10,11zu induzieren.

Kombiniert Erkennung des ZNS infiltrieren Immunzelle mit BBB liefert Leckage und Gelatinase Tätigkeit in CNS Gewebeschnitten wertvolle Informationen über die Funktionsfähigkeit der Endothelzellen und glialen Barriere im Rahmen des Neuroinflammation. Zum Beispiel haben wir vor kurzem untersucht den konstitutiven Verlust der endothelialen tight Junction Molekül Knoten Adhäsionsmolekül (JAM)-B Menschenhandel Immunzellen in das ZNS im Zusammenhang mit EAE. Im Vergleich zu gesunden Wildtyp C57BL/6 Mäusen, gesunde Marmelade-B-defizienten Wurfgeschwistern zeigte keine Beeinträchtigung der BBB Integrität über endogene als auch exogene Tracer¹²Durchlässigkeit in-vivo-Tests belegen. Im Rahmen der EAE JAM-B-defizienten C57BL/6 Mäusen zeigte verbesserte Krankheitssymptome, die wurde im Zusammenhang mit entzündlichen Zelle Überfüllung in den Leptomeningeal und perivaskuläre Räume¹². Dieses Phänomen untersuchen wir zugewiesen in Situ Zymography zur Identifizierung von Gelatinase Aktivität um zu testen, ob mangelnde Gelatinase Aktivität in den JAM-B-defizienten Mäusen möglicherweise verantwortlich für die reduzierte Zahl der Immunzellen in der Lage zu durchbrechen die Glia Limitans¹².

Angesichts der Verfügbarkeit von veränderten verschiedenen gentechnisch Maus Modelle fehlen, z. B. verschiedene BBB tight Junction-Moleküle, die Änderungen in der BBB-Funktion verursachen könnten Methoden für die Untersuchung von BBB Integrität wichtig sind. Darüber hinaus könnte neu entwickelte Medikamente auf NVU Barrieren auswirken. Hier zeigen wir wie bei C57BL/6 Mäusen durch aktive Immunisierung mit Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG) induzieren EAE-Peptid aa35-55 in komplette Freund Adjuvantien. Wir erklären dann wie Immunzelle Infiltration über die NVU Endothelzellen und glialen Barrieren hinweg zu lokalisieren und in-vivo Endothelzellen und glialen Barriereintegrität durch in-situ Detektion von exogenen Tracer und Gelatinase Aktivität, bzw. zu studieren.

Protocol

Alle Studien wurden durchgeführt in den Leitlinien nach der schweizerischen Gesetzgebung über den Schutz der Tiere und durch das Veterinäramt des Kantons Bern in der Schweiz angenommen wurden (Erlaubnis Zahlen: BE 31/17 und werden 77/18). 1. Gehäuse von C57BL/6 Mäusen in spezifischen Erreger frei (SPF) Bedingungen Hausmäuse in einzelnen belüftete Käfige mit einem 12/12 h hell-dunkel-Zyklus. Nahrung und Wasser Ad Libidum. Um mikrobiologische Qualität der Mäuse zu überwache…

Representative Results

Bewertung der klinische Verlauf der EAE bei C57BL/6 Mäusen sollte eine Krankheit Kurve wie in Abb. 2A und Änderungen in der Maus Körpergewicht wie dargestellt in Abbildung 2 bdargestellt führen. C57BL/6 Mäusen immunisiert mit MOGaa35-55 in der Regel beginnen Krankheitssymptome rund um 10-12. Tag nach der aktiven Immunisierung (Abbildung 1A) zu entwickeln. Immunisierten Mäusen zeigen in der Regel vorübergehend sinken des Körp…

Discussion

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll überwachen EAE in weiblichen C57BL/6 Mäusen zu induzieren. Frauen werden bevorzugt ausgewählt, und es gibt eine Inzidenz von Frauen: Männer 3:1 im MS. Zur Beurteilung der Schwere der EAE, wir haben eine 3-Punkt-Wertungsblatt nutzen. EAE Schweregrad wird in der Regel in Bezug auf den Schweregrad der motorischen Funktionsstörungen bewertet. Mäuse mit fortgeschrittenen Stadien der EAE, d.h. ausstellen eine Punktzahl über 2 geopfert werden sollte, um unnötiges Leiden der Tie…

Materials

AMCA anti-rabbit antibody	Jackson ImmunoResearch	111-156-045	Store at 4 °C; protect from light
Anti-CD45 Antibody (30F11)	Pharmingen	07-1401	Store at 4 °C
Anti-Laminin Antibody	DAKO	Z0097	Store at 4 °C
Breeding food	e.g. PROVIMI KLIBA SA	3336
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III	e.g. Tecniplast	1145T, 1285L
BSA fraction V	Applichem	A1391	Store at 4 °C
Cold gelatine	Sigma-Aldrich	G 9391
Coplin jar + rack	e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG	H554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antibody	Jackson ImmunoResearch	111-156-144	Store at 4 °C; protect from light
Cover slips 24 x 40 mm # 1	e.g. Thermo Scientific	85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW)	e.g. Molecular probes	D22910	Store at -20 °C; protect from light
Dextran Texas Red (3000 MW)	Invitrogen	D3328	Store at -20 °C; protect from light
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit	Thermo Fisher Scientific; EnzCheck	E12055	Store at -20 °C; protect form light
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks)	e.g. Janvier Labs		Females, 8-12 weeks
Freezing box for histology slides	e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG	2285.1
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle	e.g. BD, BD Microlance 3	304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle	e.g. BD, BD Microlance 3	302200
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle	e.g. BD, BD Microlance 3	304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	e.g. Santa Cruz Biotechnology	sc-24648	Store at 4°C
Maintenance food	e.g. PROVIMI KLIBA SA	3436
MOGaa35-55 peptide	e.g. GenScript		Store at -80 °C
microscope slides (Superfrost Plus )	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA	e.g. BD	231141	Store at 4 °C
NaCl 0.9 %	B. Braun	3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek )	Sakura	4583
Omnican 50 30G x ½’’	B. Braun	9151125S
Paraformaldehyde	Merck	30525-89-4
Pertussis toxin	e.g. List biological laboratories, Inc.	180	Store at 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88)	Sigma-Aldrich	81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche)	Sigma-Aldrich	4693132001	Store at 4 °C
repelling pen e.g. DAKO Pen	e.g. DAKO	S2002
sealing film e.g. Parafilm M	e.g Sigma-Aldrich	P7793
Silica gel	e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG	9351.1
Stitch scissor	F.S.T	15012-12
syringe 1 ml	e.g. PRIMO	62.1002
syringe 10 ml	e.g. CODAN Medical ApS	2022-05
vaporizer system Univentor 400	UNO.BV